細(xì)胞內(nèi)單顆粒示蹤技術(shù)的進(jìn)展

王德江，狄香君，王寶明，王 帆，郭智勇，金大勇*

(1.悉尼科技大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)材料及儀器研究所，澳大利亞 悉尼 2007;2.西南石油大學(xué) 機(jī)電工程學(xué)院，四川 成都 610500)

1 引 言

細(xì)胞是生物體基本的結(jié)構(gòu)和組成單位，了解細(xì)胞功能復(fù)雜性首先要清楚細(xì)胞內(nèi)分子和顆粒的動(dòng)力學(xué)特征。在活細(xì)胞中，分子和顆粒的運(yùn)動(dòng)具有時(shí)空多樣性，因此要分析它們的具體特征需要對(duì)其進(jìn)行高時(shí)空分辨率的長(zhǎng)時(shí)間追蹤。在過(guò)去的30多年里，各種各樣的技術(shù)被用于探究細(xì)胞內(nèi)分子和顆粒的動(dòng)力學(xué)特征，其中，光漂白后的恢復(fù)技術(shù)(Fluorescence recovery after photobleaching，F(xiàn)RAP)[1-2]和熒光相關(guān)光譜技術(shù)(Fluorescence correlation spectroscopy，F(xiàn)CS)[3-4]被人們廣泛使用。FRAP技術(shù)是將熒光標(biāo)簽與靶分子偶聯(lián)，然后用強(qiáng)激光束小范圍內(nèi)照射帶有標(biāo)簽的分子，被激光束照射的部分會(huì)發(fā)生熒光漂白現(xiàn)象，當(dāng)激光照射停止后，該范圍內(nèi)的熒光強(qiáng)度被記錄下來(lái)，而周圍環(huán)境中的熒光分子由于布朗運(yùn)動(dòng)會(huì)擴(kuò)散至漂白區(qū)域，通過(guò)計(jì)算該區(qū)域內(nèi)隨時(shí)間而變化的熒光強(qiáng)度，可以得到靶分子的擴(kuò)散速率[5]。FRAP可以用于探究細(xì)胞膜上蛋白質(zhì)的運(yùn)動(dòng)[1]和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)[2]。而FCS則是通過(guò)測(cè)定由于粒子進(jìn)出微小的檢測(cè)體積而造成的熒光信號(hào)的漲落來(lái)獲取粒子的動(dòng)態(tài)參數(shù)，如擴(kuò)散系數(shù)，以及通過(guò)Stokes-Einstein方程計(jì)算分析物濃度，流體力學(xué)半徑[6-7]。FCS也可以用于活細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)力學(xué)研究[3-4]。盡管FRAP和FCS可以實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)活細(xì)胞內(nèi)快速的動(dòng)態(tài)過(guò)程(時(shí)間分辨率小于毫秒)，但是空間分辨率存在衍射極限的限制。此外，F(xiàn)RAP和FCS只能提供分子的平均信息，不具有功能上的異質(zhì)性。

另一種既具有高時(shí)間分辨率也能達(dá)到高空間分辨率的方法是單顆粒示蹤技術(shù)(Single Particle Tracking，SPT)。利用SPT技術(shù)，研究人員可以獲得FRAP和FCS不具備的信息，因?yàn)镾PT是在納米精度上精確地定位每個(gè)單獨(dú)的顆粒，并測(cè)量其個(gè)體動(dòng)力學(xué)作為時(shí)間的函數(shù)，而不是在一定時(shí)間內(nèi)整體的平均水平。SPT技術(shù)起源于20世紀(jì)80年代，Brabander課題組第一次在活細(xì)胞內(nèi)觀察到大小為40 nm的膠體金顆粒[8-9]。將膠體金顆粒附著于靶分子上，借助具有視頻功能的微分干涉差顯微鏡，通過(guò)連續(xù)記錄獲得顆粒中心的空間坐標(biāo)。該方法比較簡(jiǎn)單，常用來(lái)追蹤細(xì)胞膜上分子或顆粒的動(dòng)態(tài)過(guò)程[10]。但是金顆粒尺寸比較大，常常會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)生物分子正常的生理功能。1993年，關(guān)于熒光顯微鏡的研究取得重大突破：可以在室溫條件下檢測(cè)單分子[11]，該技術(shù)推動(dòng)了SPT的發(fā)展，熒光分子和熒光蛋白逐漸作為SPT的分子標(biāo)簽[12-13]。1996年，使用有機(jī)染料作為熒光標(biāo)簽，可以在合成膜上觀察脂質(zhì)的運(yùn)動(dòng)[14]。2000年，能夠在活細(xì)胞內(nèi)觀察到信號(hào)受體和脂質(zhì)的運(yùn)動(dòng)[12,15]。2003年，Dahan第一次使用量子點(diǎn)(QDs)作為熒光標(biāo)簽，在活細(xì)胞膜上追蹤單個(gè)甘氨酸受體的擴(kuò)散過(guò)程[16]。自此，量子點(diǎn)廣泛用于SPT技術(shù)，例如細(xì)胞膜以及細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)過(guò)程的追蹤[17-20]，最近也用于腦切片中分子表面動(dòng)力學(xué)的研究[21]。在SPT中，QDs是使用最廣泛的熒光標(biāo)簽，近些年也有其他幾種熒光標(biāo)簽興起，例如，2011年，Sang Hwan Nam第一次在活細(xì)胞內(nèi)追蹤上轉(zhuǎn)換納米顆粒(UCNPs)的內(nèi)吞過(guò)程，時(shí)間長(zhǎng)達(dá)6 h[22]。

盡管SPT技術(shù)發(fā)展迅速，可以在活細(xì)胞內(nèi)監(jiān)測(cè)許多生物分子的動(dòng)態(tài)行為，例如細(xì)胞內(nèi)分子馬達(dá)的運(yùn)動(dòng)[23-24]；細(xì)胞膜上分子的內(nèi)吞機(jī)制[25]等，這些發(fā)現(xiàn)幫助我們了解活細(xì)胞內(nèi)生物分子的時(shí)空分布。但是，大多數(shù)都是有關(guān)細(xì)胞膜的研究，對(duì)于細(xì)胞內(nèi)狹窄區(qū)域或者是更復(fù)雜的分子環(huán)境(例如細(xì)胞核，組織)則很難追蹤，因此，研究人員也在算法，光學(xué)技術(shù)以及光學(xué)材料方面不斷優(yōu)化SPT技術(shù)，從而獲得更多的生物信息。

本文主要介紹SPT技術(shù)動(dòng)力學(xué)原理和其在活細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)用，首先介紹了SPT技術(shù)的基礎(chǔ)知識(shí)，包括單顆粒的定位，運(yùn)動(dòng)軌跡的重建以及數(shù)據(jù)分析，重點(diǎn)介紹了光學(xué)材料、顯微鏡的種類以及優(yōu)缺點(diǎn)，然后分析了SPT在細(xì)胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)病毒上的應(yīng)用，最后給出SPT未來(lái)可能的發(fā)展方向。

2 SPT技術(shù)

2.1 動(dòng)力學(xué)原理

2.1.1 運(yùn)動(dòng)軌跡重建

對(duì)SPT數(shù)據(jù)進(jìn)行分析最主要的目的就是獲得單個(gè)粒子的運(yùn)動(dòng)軌跡，進(jìn)而通過(guò)對(duì)軌跡分析獲得相應(yīng)的生物信息，因此當(dāng)高速攝像機(jī)采集到一系列連續(xù)的圖像后，需要對(duì)每一幀圖像中的顆粒進(jìn)行定位，從而重建運(yùn)動(dòng)軌跡(圖1)。

圖1 SPT軌跡重建示意圖[27]。(a)借助PSF確定顆粒的位置; (b)只和鄰近的點(diǎn)進(jìn)行連接; (c)按照時(shí)間順序連接形成一個(gè)軌跡; (d)對(duì)軌跡進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，提取出動(dòng)力學(xué)信息 Fig.1 Schematic representation of SPT[27]. (a)Particles are localized by finding the central locations of their point spread functions; (b)localizations belonging to the same particle at different times are connected using algorithms such as nearest neighbor; (c)chronological series of linked localizations form a time series trajectory; (d)dynamic information is extracted based on a statistical analysis of the trajectories

目前常用的定位方法大多是通過(guò)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(Point spread function，PSF)進(jìn)行定位[26]，公式如下:

(1)

式中，r是點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)PSF中心的距離，J1是一級(jí)貝塞爾函數(shù)，λ是入射光的波長(zhǎng)，NA代表數(shù)值孔徑。在此基礎(chǔ)上，有兩種方法比較常用：質(zhì)心法[27]和高斯擬合法。質(zhì)心法比較簡(jiǎn)單，直接計(jì)算選定區(qū)域的光斑強(qiáng)度，單次迭代，運(yùn)算速度快，常用來(lái)追蹤過(guò)程中即時(shí)的反饋，但是由于其邊緣敏感性高，背景干擾多等因素，所以定位精確度較差。另一種方法是高斯擬和法[28]，常用的高斯曲線的公式：

(2)

式中，I0是光斑中心的強(qiáng)度，ω是標(biāo)準(zhǔn)偏差，因此，光斑強(qiáng)度的分布可以很好的用高斯曲線擬合。該方法定位準(zhǔn)確度高，常用于超分辨成像領(lǐng)域，缺點(diǎn)是計(jì)算過(guò)程中需要反復(fù)迭代，步驟繁瑣，計(jì)算速度慢。

針對(duì)某一時(shí)間內(nèi)連續(xù)的圖像進(jìn)行定位，可以得到多個(gè)點(diǎn)的精確位置，將各個(gè)點(diǎn)連接起來(lái)，即可以得到該顆粒完整的運(yùn)動(dòng)軌跡。但是在連接點(diǎn)時(shí)存在一個(gè)問(wèn)題：每個(gè)點(diǎn)都可以和多個(gè)點(diǎn)連接，常用的處理辦法是只允許相鄰的點(diǎn)進(jìn)行連接[29]。

2.1.2 運(yùn)動(dòng)軌跡分析

分子在細(xì)胞膜上的運(yùn)動(dòng)模式多種多樣，有靜止(Immobile)、正常擴(kuò)散(Pure diffusion)、異常亞擴(kuò)散(Anomalous subdiffusion)、局限性運(yùn)動(dòng)(Confined motion)以及定向運(yùn)動(dòng)(Directed motion)等多種類型。對(duì)運(yùn)動(dòng)軌跡進(jìn)行分析可以清楚顆粒的運(yùn)動(dòng)模式并獲得相關(guān)的運(yùn)動(dòng)參數(shù)，例如擴(kuò)散系數(shù)，運(yùn)動(dòng)速度，異常擴(kuò)散指數(shù)，圍欄類型等。

最常用的一種數(shù)據(jù)分析方法是均方位移法(Mean square displacement,MSD)。MSD指的是在整條軌跡內(nèi)具有相同時(shí)間間隔的所有點(diǎn)對(duì)間距離的平均值[28-30]，因此我們可以借助MSD與時(shí)間間隔的依賴關(guān)系對(duì)運(yùn)動(dòng)模式進(jìn)行分類，分類如下：

〈r2〉=4Dt, 正常擴(kuò)散 ，

(3)

〈r2〉=4Dta, 異常擴(kuò)散，

(4)

〈r2〉=4Dt+(Vt)2, 定向擴(kuò)散，

(5)

圍欄運(yùn)動(dòng),

(6)

正常擴(kuò)散(Normal diffusion)即為布朗運(yùn)動(dòng)，擴(kuò)散系數(shù)恒定不變，我們可以根據(jù)公式(3)的斜率得到擴(kuò)散系數(shù)D；定向擴(kuò)散模式(Directed motion with diffusion)是指細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)沿細(xì)胞骨架的運(yùn)動(dòng)，對(duì)應(yīng)公式(5)，將MSD作為時(shí)間的函數(shù)可以擬合得到一條二次函數(shù)曲線，進(jìn)而可以算出擴(kuò)散系數(shù)D和流速V；異常擴(kuò)散模式(Anomalous diffusion)存在兩種情況，一種是顆粒受到阻礙而減速，另外一種是顆粒被捕獲并發(fā)生相互作用，如公式(4)，大多數(shù)情況下α是在0.2～0.9之間，此時(shí)屬于異常亞擴(kuò)散。對(duì)異常擴(kuò)散的研究可以幫助我們了解細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)。最后一種運(yùn)動(dòng)模式是圍欄運(yùn)動(dòng)(Corralled diffusion)，是顆粒在小范圍區(qū)域內(nèi)的運(yùn)動(dòng)(公式(6))。每種運(yùn)動(dòng)模式不是單獨(dú)存在，在一條軌跡中可能存在多種運(yùn)動(dòng)模式，因此我們需要將軌跡拆分成幾段，每段單獨(dú)進(jìn)行MSD分析。

2.2 SPT的光學(xué)材料

在SPT實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)單顆粒的光學(xué)檢測(cè)仍然很困難，我們需要從復(fù)雜的背景信號(hào)中找到靶分子的信號(hào)，最直接的方法是將靶分子貼上標(biāo)簽。理想的標(biāo)簽又小又亮，既能在光學(xué)顯微鏡下看得見(jiàn)又不影響靶分子的生理功能[31-32]。

起初，SPT使用的是散射標(biāo)簽，例如：乳膠微珠，聚苯乙烯微球，二氧化硅微粒以及金顆粒[33]。這些標(biāo)簽的優(yōu)點(diǎn)是穩(wěn)定，既不存在光漂白現(xiàn)象，也不存在生物降解，散射面較大，因此可以長(zhǎng)時(shí)間監(jiān)測(cè)單分子的運(yùn)動(dòng)(時(shí)間尺度可以達(dá)到分鐘級(jí))，而且具有較高的時(shí)間分辨率(幀速率可達(dá)到40 kHz)和空間分辨率(1～10 nm)。然而，由于標(biāo)簽的體積較大以及瑞利散射，限制了它在生物領(lǐng)域的應(yīng)用[28]。

SPT的另一類標(biāo)簽是熒光標(biāo)簽。有機(jī)熒光染料可能是最小的熒光標(biāo)簽，直徑在1 nm到2 nm之間，可以對(duì)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA分子等進(jìn)行熒光標(biāo)記，但是具有細(xì)胞毒性[27]。熒光蛋白的尺寸略大于有機(jī)染料，它可以通過(guò)基因編碼的方式整合到生物分子上，避免對(duì)生物分子進(jìn)行化學(xué)修飾。然而，熒光蛋白具有光閃性[34]且穩(wěn)定性差，追蹤時(shí)間最多只有1 s，不能長(zhǎng)時(shí)間觀察細(xì)胞內(nèi)生物分子的運(yùn)動(dòng)。另一個(gè)使用比較廣泛的熒光標(biāo)簽是量子點(diǎn)(Quantum Dots，QDs)[16]，它是一種納米級(jí)的半導(dǎo)體，發(fā)出的波長(zhǎng)可以隨著尺寸改變而變化，因而通過(guò)調(diào)節(jié)半導(dǎo)體的尺寸就可以控制其發(fā)出的光的顏色。與有機(jī)熒光染料與熒光蛋白相比，QDs具有較好的光穩(wěn)定性[35]，可以對(duì)標(biāo)記的分子長(zhǎng)時(shí)間觀察(時(shí)間尺度長(zhǎng)達(dá)幾分鐘)，而且具有寬的激發(fā)譜和窄的發(fā)射譜，可以進(jìn)行多色檢測(cè)[35]。QDs的缺點(diǎn)是具有光閃性[36]，大量存在無(wú)輻射的粒子[36]以及潛在的毒性[37]，因此研究人員也在努力尋找其他具有更好光學(xué)性能的標(biāo)簽。

近幾年，新興起的標(biāo)簽正在逐漸引起人們的關(guān)注，有碳量子點(diǎn)(Carbon nanodots，CDs)，納米鉆石(Nanodiamonds，NDs)，碳納米管(single-walled carbon nanotubes，SWNTs)以及鑭系摻雜的上轉(zhuǎn)換納米顆粒(lanthanide ion doped upconverting nanoparticles，UCNPs)。CDs是直徑小于10nm的碳納米顆粒，與傳統(tǒng)的QDs相比，CDs具有很多優(yōu)點(diǎn)，例如發(fā)光強(qiáng)度高，水溶性好，低毒，抗漂白能力強(qiáng)，因此CDs有很好的應(yīng)用潛能[38-39]。NDs具有很高的光穩(wěn)定性，不存在光閃性和光漂白，可用于細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間追蹤(長(zhǎng)達(dá)幾小時(shí))[40]。據(jù)報(bào)道，在同等條件下激發(fā)，NDs要比有機(jī)染料亮很多[41]。然而，NDs的激發(fā)波長(zhǎng)是488 nm或532 nm，會(huì)對(duì)細(xì)胞造成光損傷而且組織穿透力較差[22]，此外，由于本身結(jié)構(gòu)的問(wèn)題，NDs無(wú)法做特異性標(biāo)記。相比之下，SWNTs則更適用于細(xì)胞內(nèi)成像，因?yàn)樗募ぐl(fā)和發(fā)射光譜都在近紅外光譜區(qū)域，但是SWNTs長(zhǎng)達(dá)100 nm左右，體積太大不適合做生物標(biāo)簽[42-43]。UCNPs因其獨(dú)特的光學(xué)特性，逐漸引起人們的關(guān)注。它被近紅外光激發(fā)，卻發(fā)射可見(jiàn)光，不具有光閃性和光漂白，毒性低，最重要的是近紅外光激發(fā)不會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)的自發(fā)熒光，也不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成光損傷[22,44-45]。雖然與其他幾種熒光材料相比，UCNPs具有穩(wěn)定的光學(xué)性能，但是隨著顆粒尺寸減小它的發(fā)光強(qiáng)度也會(huì)相應(yīng)減弱，因此研究人員也在嘗試用不同的合成策略改善UCNPs的性質(zhì)(例如增大發(fā)光強(qiáng)度并縮小顆粒大小)[46]，期望可以更好的用于生物領(lǐng)域。

SPT的發(fā)展與標(biāo)簽庫(kù)的豐富息息相關(guān)，每種標(biāo)簽都有優(yōu)缺點(diǎn)以及適用的范圍，研究人員應(yīng)該根據(jù)研究對(duì)象，合理選擇標(biāo)簽。

2.3 單分子判定原則

在SPT實(shí)驗(yàn)中，我們要追蹤和分析的是細(xì)胞內(nèi)單個(gè)分子的動(dòng)力學(xué)行為，所以確保研究對(duì)象是單分子極其重要。依據(jù)分子標(biāo)簽和檢測(cè)方式的不同，單分子判定原則也略有差別。有以下3個(gè)原則[47]：

(1)被標(biāo)記的靶分子在特定波長(zhǎng)下發(fā)射熒光，而雜質(zhì)的散射光波長(zhǎng)范圍很寬，可以通過(guò)更換不同的濾鏡進(jìn)行區(qū)分，在多個(gè)濾鏡下均有信號(hào)的是雜質(zhì)，反之，則為靶分子。

(2)對(duì)于QDs，可以通過(guò)是否閃爍進(jìn)行判斷。如果是多個(gè)QD聚合在一起，熒光強(qiáng)度彼此互補(bǔ)，很難觀察到閃爍現(xiàn)象。

(3)熒光分子存在光漂白現(xiàn)象，在發(fā)生光漂白之前，每個(gè)熒光團(tuán)發(fā)射的光子數(shù)是一定的，可以統(tǒng)計(jì)每個(gè)光斑的光子數(shù)，如果數(shù)值與理論光子數(shù)一致，則說(shuō)明是單分子。

滿足的條件越多，則越能確定是單分子。目前，在判定單顆粒方面還存在一定的難度，科研人員也在嘗試從多方面進(jìn)行檢驗(yàn)。

2.4 SPT的光學(xué)系統(tǒng)

2.4.1 單分子寬場(chǎng)成像

由于常用熒光分子作標(biāo)簽，所以高靈敏度的檢測(cè)器也是SPT成像裝置的重要組成部分。最基本的檢測(cè)器是寬場(chǎng)檢測(cè)器(Wide-field detectors)[48]，多數(shù)是基于電荷耦合裝置的照相機(jī)(CCD)。寬場(chǎng)檢測(cè)可以提供分子的位置，軌跡，光譜等信息，既具有單分子檢測(cè)的高靈敏優(yōu)勢(shì)，又具有操作簡(jiǎn)單，結(jié)果直觀，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的特點(diǎn)。按照照明方式的不同，主要可以分為落射式熒光成像，全內(nèi)反射熒光成像和大入射角光學(xué)薄層照明成像。

2.4.1.1 落射式熒光成像

在常規(guī)熒光顯微鏡基礎(chǔ)上安裝高靈敏度的檢測(cè)器，合適的濾鏡和高數(shù)值孔徑的物鏡以后，即可以用于單分子檢測(cè)。如(圖 2(a))，一般情況下，激光束聚焦在物鏡的后焦面上以便得到平行光束，可以在局部區(qū)域內(nèi)穿透樣品，然后將樣品發(fā)射的熒光經(jīng)濾鏡過(guò)濾，最后用CCD檢測(cè)。在CCD前面放置一個(gè)像增強(qiáng)器，即為ICCD[27]，時(shí)間分辨率可以達(dá)到納秒級(jí)別，但是量子效率很低(20%～50%)。其他比較靈敏的CCD有電子倍增CCD(EMCCD)[49]和科學(xué)型互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體(sCMOS)[27]，EMCCD量子效率能夠達(dá)到90%以上，但是時(shí)間分辨率卻遠(yuǎn)低于ICCD，而sCMOS的量子效率是70%，稍微低于EMCCD，但是幀速很高，可以達(dá)到每秒幾百幀。單光子雪崩光電二極管檢測(cè)器(SPAD)是目前新興的光子檢測(cè)器，靈敏度極高，讀出噪聲為零，可以檢測(cè)到極弱的信號(hào)，時(shí)間分辨率能夠達(dá)到微秒級(jí)，非常適合活細(xì)胞內(nèi)成像[50]。

圖2 寬場(chǎng)成像的方法[28]。(a)TIRF或者Epi方法的簡(jiǎn)單裝置圖；(b)不同的照明方案，包括Epi、TIRF以及HILO Fig.2 Different optical schemes for wide-field imaging[28]. (a)Simplest implementation of Epi or TIRF mode; (b)different illumination schemes, including Epi, TIRF and HILO

2.4.1.2 全內(nèi)反射熒光成像

對(duì)于活細(xì)胞內(nèi)的SPT實(shí)驗(yàn)，大多數(shù)背景干擾來(lái)自于細(xì)胞的自發(fā)熒光，所以如何減少背景干擾是當(dāng)務(wù)之急，最簡(jiǎn)單的方法就是減少照明。全內(nèi)反射熒光(Total internal reflection fluorescence，TIRF)就是利用這一原理成像(圖 2(b))。當(dāng)激發(fā)光在玻璃-水界面處全反射后產(chǎn)生衰逝波，衰逝波成指數(shù)形式衰減，因此只有靠近全反射的樣品區(qū)域才會(huì)產(chǎn)生熒光，觀測(cè)深度通常在200 nm以內(nèi)，避免了細(xì)胞內(nèi)的自發(fā)熒光[51]。TIRF確保了高信噪比，并且由于基底細(xì)胞膜通常與玻璃表面接觸，因此TIRF非常適合細(xì)胞膜的研究。然而，這也是該技術(shù)的局限，因?yàn)橹挥谢准?xì)胞表面和質(zhì)膜下方的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域才能被激發(fā)到。

2.4.1.3 大入射角光學(xué)薄層照明成像

大入射角光學(xué)薄層照明成像(Highly Inclined and Laminated Optical Sheet ，HILO)可以觀察到細(xì)胞內(nèi)的不同區(qū)域[52]。與全內(nèi)反射熒光不同，HILO是激光束以一個(gè)傾斜的薄層光束穿過(guò)樣品中心(圖 2(b))。因?yàn)橹挥屑?xì)胞內(nèi)薄薄的一層被激光照射到，因此在很大程度上減少了背景噪聲，但同時(shí)該方法也限制了其在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)的深度，而且只能觀察到樣品的中心，在樣品的邊緣處，由于傾斜的激光束分別照在焦平面的上方和下方，導(dǎo)致圖像模糊。

2.4.2 共聚焦成像

圖3 共聚焦顯微鏡原理示意圖[53] Fig.3 A schematic representation of the optical path in a confocal fluorescence microscope[53]

傳統(tǒng)的寬場(chǎng)熒光顯微鏡在觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)時(shí)可以達(dá)到亞微米級(jí)空間分辨率以及較好的時(shí)間分辨率，但是無(wú)法規(guī)避掉焦平面外的熒光信號(hào)，當(dāng)對(duì)樣品進(jìn)行三維成像時(shí)，會(huì)導(dǎo)致圖像模糊。共聚焦顯微鏡解決了這個(gè)問(wèn)題，激光束經(jīng)照明針孔形成點(diǎn)光源，然后點(diǎn)光源對(duì)樣品內(nèi)焦平面的每一點(diǎn)進(jìn)行掃描，最后在探測(cè)針孔處成像，有效的消除了焦平面以外的熒光(圖3)。雖然這種方法在一定程度上提高了信噪比，但是圖像的重建需要對(duì)樣品或者激發(fā)光進(jìn)行掃描，致使采集速率降低(<10幀/秒)，因此只適用于比較緩慢的動(dòng)態(tài)分析。目前發(fā)展比較迅速的是轉(zhuǎn)盤式共聚焦顯微鏡(Spinning-disk confocal microscopy)，不僅保留了激光共聚焦的優(yōu)點(diǎn)，而且還可以對(duì)樣品快速成像，專門用來(lái)解決快速的動(dòng)態(tài)檢測(cè)問(wèn)題，與激光共聚焦相比，圖像的采集速率可以提高一個(gè)數(shù)量級(jí)[54-55]。

2.4.3 超分辨成像

光學(xué)顯微鏡的成像系統(tǒng)存在衍射限制，即顯微鏡的分辨率具有物理極限，為了獲得更多細(xì)胞內(nèi)的細(xì)節(jié)信息，科研人員迫切需要超高分辨率的顯微鏡。發(fā)展最早的是受激發(fā)射損耗熒光顯微鏡(Stimulated Emission Depletion Microscopy，STED)，一個(gè)典型的STED需要兩束光，一束為激發(fā)光，一束為損耗光，激發(fā)光照射使熒光分子被激發(fā)，損耗光則使部分處于光斑外圍的電子以受激發(fā)射的方式回到基態(tài)，而位于光斑中心的電子仍以自發(fā)熒光的形式回到基態(tài)，因此檢測(cè)器只能收集到來(lái)自光斑中心的光，從而實(shí)現(xiàn)超高分辨率。2009年，Schmidt借助STED觀察到線粒體嵴結(jié)構(gòu)，分辨率為30 nm[44]。

另一種超分辨顯微鏡是光激活定位顯微鏡(Photoactivated Localization Microscopy ，PALM)，1994年由Eric Betzig提出。當(dāng)PALM用于SPT時(shí)(sptPALM)，通過(guò)激活、定位、光漂白多種可光活化的熒光蛋白子集來(lái)獲得單分子的位置信息[56]。通過(guò)探測(cè)分子的不同子集，sptPALM可以提供細(xì)胞膜在空間和時(shí)間上的異質(zhì)性[56-58]。sptPALM的缺點(diǎn)是熒光蛋白的光學(xué)物理性質(zhì)較差，而且，需要高轉(zhuǎn)染效率的熒光蛋白。

通用點(diǎn)積累納米成像(Universal Points-Accumulation-for-Imaging-in-nanoscale Topography，uPAINT)利用溶液中的熒光配體對(duì)少量的生物分子進(jìn)行連續(xù)、隨機(jī)標(biāo)記，然后通過(guò)傾斜照明成像[59]。該方法使用傳統(tǒng)的有機(jī)染料作為熒光標(biāo)簽，因此得到的軌跡(幾十秒)要長(zhǎng)于PALM，但是成像速度比PALM慢，而且，只適用于活細(xì)胞的體外標(biāo)記。用于SPT技術(shù)中的顯微技術(shù)多種多樣，我們可以在上述顯微技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行改造升級(jí)，從而推動(dòng)SPT的發(fā)展。

3 SPT在活細(xì)胞中的應(yīng)用

3.1 細(xì)胞膜表面蛋白動(dòng)力學(xué)的研究

細(xì)胞膜由磷脂層和蛋白質(zhì)組成，將細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)與外界環(huán)境隔離并控制物質(zhì)的進(jìn)出。細(xì)胞間的交流以及細(xì)胞與周圍環(huán)境的交流都是通過(guò)細(xì)胞膜上特定的蛋白質(zhì)(也叫受體)完成，但是對(duì)于細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)以及作用機(jī)制人們還不是很清楚。SPT的發(fā)展為研究細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及表面蛋白動(dòng)力學(xué)提供了便利[17]。

近些年SPT的研究結(jié)果表明，細(xì)胞膜是一個(gè)高度分層的結(jié)構(gòu)：膜隔室，筏域和由膜相關(guān)蛋白、整合蛋白的低聚物組成的部分，不同的層次在不同的空間內(nèi)發(fā)揮各自的作用[17,60-62]。細(xì)胞膜上最大的區(qū)域是“膜隔室”，由靠近細(xì)胞內(nèi)膜的肌動(dòng)蛋白骨架和錨定在細(xì)胞膜骨架的跨膜蛋白組成(圖 4(a))[17,63]。1995年，Yasushi Sako和Akihiro Kusumi用乳膠微珠(直徑為210 nm)和金顆粒(直徑為40 nm)標(biāo)記轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，對(duì)膜隔室的邊界進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，膜隔室確實(shí)是由膜相關(guān)的細(xì)胞骨架組成[64]。2002年，Akihiro Kusumi將熒光染料Cy3標(biāo)記的不飽和磷脂轉(zhuǎn)入大鼠成纖維細(xì)胞中，觀察它們?cè)诩?xì)胞膜上的運(yùn)動(dòng)，發(fā)現(xiàn)它們被限制在不同的隔室內(nèi)，隔室大小在30～250 nm之間[17,55]。該發(fā)現(xiàn)解釋了為什么細(xì)胞膜上的長(zhǎng)距離擴(kuò)散速率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)慢于在人造脂膜上的擴(kuò)散速率，因?yàn)榭缒さ鞍自谀す羌苌吓懦梢慌牛肿雍茈y跨過(guò)不同的隔室邊界，以“跳躍”擴(kuò)散的形式跨過(guò)隔室需要一些時(shí)間[65]。在每個(gè)隔室內(nèi)的短距離擴(kuò)散則很快，可能是布朗運(yùn)動(dòng)。

圖4 細(xì)胞膜的分層結(jié)構(gòu)[17]。(a)膜隔室層，由肌動(dòng)蛋白骨架分隔整個(gè)細(xì)胞膜形成，并且跨膜蛋白錨定在肌動(dòng)蛋白骨架上; (b)“筏域”,富含膽固醇，尺寸受到膜隔室的限制; (c)由膜相關(guān)蛋白以及整合蛋白的低聚物組成，存在時(shí)間非常短 Fig.4 Three-tiered hierarchical structure of mesoscale domains in the plasma membrane[17]. (a)Membrane compartments which stem from the partitioning of the entire plasma membrane by the membrane associated actin-based membrane skeleton(fence) and TM proteins anchored to the membrane skeleton fence(pickets); (b)cholesterol-containing raft domains, with sizes limited by the membrane compartments; (c)dimers and greater oligomers of membane associated and integral membrane proteins, which might exist only transiently

第二個(gè)區(qū)域是“筏域” (圖 4(b)),由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成，與細(xì)胞膜之間存在相互作用，可以被“筏”相關(guān)的受體調(diào)節(jié)[17]。2012年，Akihiro Kusumi課題組用熒光染料Cy3標(biāo)記“筏”相關(guān)的糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白(GPI-APs)并追蹤其在CHO-K1細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)過(guò)程，發(fā)現(xiàn)GPI-APs可以在幾百毫秒內(nèi)快速形成同源二聚體筏，而且該同源二聚體筏是極其動(dòng)態(tài)的結(jié)構(gòu)，存在時(shí)間短暫[66]。第三個(gè)區(qū)域由膜相關(guān)蛋白以及整合蛋白的低聚物組成，大小在3～10 nm之間(圖 4(c))。這些復(fù)合物可以與脂筏[67-68]，肌動(dòng)蛋白骨架[69]等發(fā)生相互作用。同時(shí)觀察QDs標(biāo)記的FcεRI和GFP標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白的運(yùn)動(dòng)軌跡表明，肌動(dòng)蛋白將FcεRI限制在了微米級(jí)的結(jié)構(gòu)域內(nèi)，而且肌動(dòng)蛋白可以在幾秒內(nèi)重組，因此由肌動(dòng)蛋白劃分的3種結(jié)構(gòu)域的位置、維度與時(shí)間相關(guān)[67]。

正是由于細(xì)胞膜獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，脂質(zhì)和蛋白質(zhì)在膜上的運(yùn)動(dòng)是極其復(fù)雜的，多數(shù)情況是異常擴(kuò)散。隨著分子大小不同，持續(xù)時(shí)間不同，擴(kuò)散也隨之改變[17,63,70]。Fujivara認(rèn)為，分子在細(xì)胞膜上以受限運(yùn)動(dòng)和跳躍式的擴(kuò)散形式在運(yùn)動(dòng)[65]。但是，Stefan Wieser用單分子熒光顯微鏡追蹤活細(xì)胞T24膜上GPI錨定蛋白CD59時(shí)，并沒(méi)有觀察到直接的跳躍式擴(kuò)散[71]。因此，SPT的發(fā)展將幫助我們獲得更多的細(xì)節(jié)信息，不同課題組提出不同的觀點(diǎn)，使研究更加深入。

除此之外，科研人員也利用SPT技術(shù)對(duì)細(xì)胞膜上的受體進(jìn)行研究，例如甘氨酸，表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)，GABA，人表皮生長(zhǎng)因子受體-2(HER2)，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)，干擾素，不同的跨膜蛋白和水通道蛋白等[72]。基于金納米顆粒的SPT技術(shù)用來(lái)追蹤β3-干擾素[73]和EGFR[74]。2017年，Kuangcai Chen利用示差—微分干涉差顯微鏡實(shí)現(xiàn)了5D SPT，追蹤轉(zhuǎn)鐵蛋白—金納米棒在人肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞膜上的運(yùn)動(dòng)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)鐵蛋白—金納米棒在做橫向擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，同時(shí)又在做自旋運(yùn)動(dòng)[25]。

3.2 細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路和分子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究

信號(hào)通路是指能將細(xì)胞外的分子信號(hào)經(jīng)細(xì)胞膜傳入細(xì)胞內(nèi)并發(fā)揮效應(yīng)的一系列酶促反應(yīng)通路。這些細(xì)胞外的分子信號(hào)也可叫做配體，當(dāng)配體特異性結(jié)合在細(xì)胞膜或者細(xì)胞內(nèi)受體后會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，因此了解膜蛋白活化后的內(nèi)化和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制對(duì)于理解信號(hào)通路至關(guān)重要。通過(guò)對(duì)QDs進(jìn)行修飾，并作為配體與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合從而激活通路，實(shí)現(xiàn)了對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)以及內(nèi)化過(guò)程的觀察[75-76]。Dhiraj Bhatia將QDs包裹在DNA多面體中，從而可以定量地修飾上配體(例如葉酸，半乳糖苷凝集素-3)，追蹤了細(xì)胞的內(nèi)吞途徑[77]。Sang Hwan Nam等人第一次在單囊泡水平上觀察UCNPs的內(nèi)吞過(guò)程，追蹤時(shí)間長(zhǎng)達(dá)6 h，發(fā)現(xiàn)UCNPs內(nèi)吞后存在3種運(yùn)動(dòng)方向：(1)受動(dòng)力蛋白影響的UCNPs，運(yùn)動(dòng)方向從細(xì)胞質(zhì)向核周區(qū)；(2)受驅(qū)動(dòng)蛋白影響的UCNPs，運(yùn)動(dòng)方向從核周區(qū)向細(xì)胞質(zhì)；(3)還存在一些UCNPs，具有雙向運(yùn)動(dòng)的特點(diǎn)[22]。

SPT技術(shù)也可以用于探究細(xì)胞內(nèi)不同分子的動(dòng)力學(xué)特征，例如對(duì)分子馬達(dá)的追蹤[23-24,78]，F(xiàn)akhri課題組用SWNTs標(biāo)記COS-7細(xì)胞內(nèi)的驅(qū)動(dòng)蛋白，觀察到驅(qū)動(dòng)蛋白運(yùn)輸過(guò)程中的新型運(yùn)動(dòng)模式—一種主動(dòng)的隨機(jī)“攪拌”模式[79]。David M. Warshaw用兩種具有不同發(fā)射光譜的QDs標(biāo)記同一個(gè)肌球蛋白的兩個(gè)頭部，發(fā)現(xiàn)當(dāng)肌球蛋白在肌動(dòng)蛋白絲上運(yùn)動(dòng)時(shí)，它的兩個(gè)頭部以72 nm的步長(zhǎng)交替出現(xiàn)在肌動(dòng)蛋白絲上，而且，在停止運(yùn)動(dòng)時(shí)，頭間距為36 nm，這說(shuō)明肌球蛋白在肌動(dòng)蛋白絲上的運(yùn)動(dòng)模式是兩頭交替運(yùn)動(dòng)式(Hand-over-hand)[18]。Nan等人用QDs追蹤人類肺癌細(xì)胞A549中的馬達(dá)蛋白，發(fā)現(xiàn)驅(qū)動(dòng)蛋白和動(dòng)力蛋白在微管上運(yùn)動(dòng)時(shí)步長(zhǎng)為8 nm，然而有時(shí)候還能觀察到步長(zhǎng)為16 nm或者24 nm的情況，可能是因?yàn)槎鄠€(gè)馬達(dá)蛋白在運(yùn)輸同一個(gè)物質(zhì)時(shí)存在相互合作[19]。

圖5 單個(gè)QD-驅(qū)動(dòng)蛋白在活細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)動(dòng)[20]。(a)Hela細(xì)胞的明場(chǎng)圖像；(b)將連續(xù)的600幀圖像疊加得到的最終圖像，線性軌跡表示單個(gè)QD-驅(qū)動(dòng)蛋白做定向運(yùn)動(dòng)(實(shí)心箭頭)，空心箭頭表示的是其他一些QD-驅(qū)動(dòng)蛋白做隨機(jī)運(yùn)動(dòng) Fig.5 Single QD-kinesin motions in a living cell[20]. (a)Bright-field image of a HeLa cell; (b)image obtained by superimposing the 600 consecutives frames in the image sequence. The linear traject-ories are indicative of directed motions of individual QD-kinesin. Examples are marked by the full arrows. The trajectories of diffusing QD-Ks(marked by empty arrowheads) have a random shape in the superimposed image

將SPT技術(shù)與超分辨成像結(jié)合可以觀察細(xì)胞內(nèi)微管的運(yùn)輸[80]以及細(xì)胞器內(nèi)蛋白復(fù)合物的動(dòng)態(tài)組織過(guò)程[81]。Yoo等人將Anti-Tubulin抗體修飾的QDs轉(zhuǎn)入到細(xì)胞內(nèi)并與微管結(jié)合，發(fā)現(xiàn)anti-tubulin-QDs向前或向后運(yùn)動(dòng)，平均速度為50.3 nm/s，揭示了微管的動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)[82]。Courty用QDs標(biāo)記Hela細(xì)胞內(nèi)的驅(qū)動(dòng)蛋白，發(fā)現(xiàn)驅(qū)動(dòng)蛋白在微管上做定向運(yùn)動(dòng)(圖5)，平均速率是(0.57±0.02) μm/s[20]。據(jù)nature報(bào)道，Alex M.Valm利用共聚焦顯微鏡和柵格激光層照顯微鏡(lattice light sheet microscope)實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞器(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高爾基體，溶酶體，過(guò)氧化物酶體，線粒體和脂滴)數(shù)量、體積、速度、位置以及動(dòng)態(tài)膜接觸的觀察，發(fā)現(xiàn)每個(gè)細(xì)胞器都有各自的分散特點(diǎn)，而且受微管和細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的影響，細(xì)胞器間的膜接觸處于重復(fù)循環(huán)的模式[83]。

3.3 遺傳信息表達(dá)過(guò)程的研究

SPT也用于細(xì)胞核結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)的研究，通過(guò)SPT追蹤我們了解到細(xì)胞核是一個(gè)高度復(fù)雜、擁擠的環(huán)境[84-86]，因此分子在細(xì)胞核內(nèi)的擴(kuò)散也很復(fù)雜。研究人員開(kāi)發(fā)了不同的光學(xué)技術(shù)以便探究細(xì)胞核的動(dòng)力學(xué)，例如Levi課題組使用雙光子顯微鏡與軌道追蹤方法跟蹤細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)的運(yùn)動(dòng)，發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)的運(yùn)動(dòng)交替出現(xiàn)限制性布朗運(yùn)動(dòng)，快速曲線運(yùn)動(dòng)以及跳躍式的擴(kuò)散[87]。還可以借助反光片顯微鏡(Reflected light sheet microscopy)觀察細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的動(dòng)態(tài)過(guò)程，而且通過(guò)雙色-SPT可以同時(shí)觀察不同的轉(zhuǎn)錄因子以及它們的激活因子[88]。Lowe和Siegel監(jiān)測(cè)了蛋白修飾的QDs進(jìn)入細(xì)胞核的過(guò)程，發(fā)現(xiàn)核孔復(fù)合物(NPC)控制顆粒進(jìn)出細(xì)胞核的機(jī)制[89]：(1)胞質(zhì)絲增加了捕獲顆粒的面積；(2)運(yùn)輸過(guò)程中存在大小的選擇；(3)顆粒在核孔中央通道內(nèi)的運(yùn)動(dòng)屬于異常亞擴(kuò)散，而且顆粒表面受體越多，越容易進(jìn)入細(xì)胞核；(4)中央通道在功能上是不對(duì)稱的，顆粒從中央通道進(jìn)入細(xì)胞核需要Ran(小分子GTP結(jié)合蛋白)的幫助，而且Ran只存在于核表面。與SPT在細(xì)胞膜上的研究相比，對(duì)于細(xì)胞核的研究還不是很透徹，但是相信隨著光學(xué)技術(shù)的成熟，標(biāo)簽庫(kù)的豐富等一些技術(shù)的快速發(fā)展，人們會(huì)獲得更多有關(guān)細(xì)胞核的細(xì)節(jié)信息。

3.4 病毒感染機(jī)制的研究

病毒是由一個(gè)核酸分子與蛋白質(zhì)構(gòu)成的非細(xì)胞形態(tài)，通過(guò)感染宿主細(xì)胞進(jìn)行自我復(fù)制，但是對(duì)于病毒的感染機(jī)制還不是很清楚。近些年，SPT的發(fā)展使研究人員明確了解多種病毒內(nèi)化的機(jī)制，例如傳染性造血組織壞死病毒(IHNV)[90]、包膜病毒[91]、后代偽狂犬病病毒(PrV)[92]、無(wú)包膜的腺相關(guān)病毒(AAV2)[93]等等。Liu用QDs標(biāo)記H9N2病毒，發(fā)現(xiàn)流感病毒進(jìn)入細(xì)胞主要有5個(gè)階段，首先病毒在細(xì)胞表面受到限制，然后慢慢地向細(xì)胞周邊區(qū)域移動(dòng)，緊接著快速移向細(xì)胞核，在核周區(qū)做間歇性的運(yùn)動(dòng)，最后在該區(qū)域做局限運(yùn)動(dòng)[94]。Li Qin等人將QDs包裹在HIV-1中，追蹤HIV-1病毒感染巨噬細(xì)胞的過(guò)程(圖6)，發(fā)現(xiàn)HIV-1以網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的方式被內(nèi)吞，然后移位至內(nèi)體，最終通過(guò)病毒包膜介導(dǎo)的內(nèi)體融合將核酸分子釋放到宿主細(xì)胞中。他們還發(fā)現(xiàn)，HIV-1進(jìn)入細(xì)胞需要內(nèi)體和肌動(dòng)蛋白的協(xié)助，對(duì)內(nèi)體和肌動(dòng)蛋白的抑制可以阻斷HIV-1進(jìn)入細(xì)胞[95]。因此了解病毒內(nèi)吞的機(jī)制能夠幫助人們發(fā)展新型阻斷劑，有效阻斷病毒入侵人體。

圖6 HIV-1病毒侵染巨噬細(xì)胞的過(guò)程[95] Fig.6 Process of HIV-1 entry into macrophages[95]

4 結(jié)束語(yǔ)

SPT技術(shù)是研究活細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的分子動(dòng)態(tài)過(guò)程的重要手段，揭示了活細(xì)胞內(nèi)生物分子的動(dòng)力學(xué)特征。在過(guò)去30多年里，SPT技術(shù)的快速發(fā)展是物理、化學(xué)、材料、工程、生物等各個(gè)學(xué)科共同努力的結(jié)果。本文從基礎(chǔ)技術(shù)和細(xì)胞內(nèi)應(yīng)用兩方面介紹SPT，在基礎(chǔ)技術(shù)中介紹了SPT軌跡追蹤原理，光學(xué)材料以及光學(xué)儀器，使人們了解SPT是如何實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境進(jìn)行實(shí)時(shí)的監(jiān)控并提供生物信息；在應(yīng)用方面重點(diǎn)介紹SPT在單細(xì)胞內(nèi)的研究進(jìn)展，基于這些研究，人們揭示了細(xì)胞內(nèi)分子的運(yùn)輸特性，分子間的相互作用以及結(jié)構(gòu)與功能間的機(jī)制等，幫助我們更好的了解活細(xì)胞內(nèi)分子的時(shí)空分布。

雖然SPT在單細(xì)胞研究上取得了很大的成就，但是它的發(fā)展還不是很成熟，仍有許多需要完善的地方，例如在光學(xué)材料方面，我們可以對(duì)熒光蛋白進(jìn)行突變，從而獲得具有更優(yōu)異的光學(xué)物理性質(zhì)的蛋白；通過(guò)優(yōu)化UCNPs的合成策略進(jìn)而提高發(fā)光強(qiáng)度、降低粒徑；還可以將不同的熒光材料組合，例如對(duì)于一些共軛聚合物，不僅對(duì)它們的表面進(jìn)行修飾，還可以將有機(jī)染料小分子包裹進(jìn)去(例如NIR染料[96-97])，用于多光子檢測(cè)。更亮、更穩(wěn)定、低毒、多功能的光學(xué)材料必定會(huì)推動(dòng)力SPT技術(shù)的發(fā)展。

而為了更好的利用這些新型材料，我們也需要引入更有效和更高分辨率的光學(xué)技術(shù)，例如利用寬場(chǎng)追蹤與超分辨的共定位測(cè)量。近幾年，應(yīng)用結(jié)構(gòu)光照明超分辨顯微技術(shù)(SIM)可以實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞內(nèi)二維和三維實(shí)時(shí)超分辨成像。將光片照明技術(shù)與SIM結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對(duì)厚樣品的三維超分辨成像和活細(xì)胞內(nèi)雙色三維快速成像，分辨率也有了很大的提高。因此將不同的成像技術(shù)例如SIM跟SPT進(jìn)行組合、改造，會(huì)進(jìn)一步完善SPT的光學(xué)系統(tǒng)，光學(xué)的發(fā)展可以讓我們?cè)谛碌某叨壬戏治鰡?wèn)題。

復(fù)雜的光學(xué)系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)快速超分辨成像，同時(shí)也需要自動(dòng)化的數(shù)據(jù)處理來(lái)支持。我們需要對(duì)算法進(jìn)行優(yōu)化，減少計(jì)算時(shí)間，從而實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)處理，獲得更多的細(xì)節(jié)信息，例如實(shí)時(shí)分析追蹤的顆粒數(shù)目以及顆粒所處的周圍環(huán)境等。

借助具有優(yōu)異的光學(xué)物理性質(zhì)的熒光材料，超高分辨率的光學(xué)顯微系統(tǒng)，以及自動(dòng)化的數(shù)據(jù)處理，可以對(duì)細(xì)胞內(nèi)或者組織中高度局限、復(fù)雜的分子環(huán)境進(jìn)行實(shí)時(shí)追蹤，從而獲得任意時(shí)間長(zhǎng)度的3D軌跡或者是小范圍內(nèi)超多個(gè)單顆粒的運(yùn)動(dòng)軌跡。同時(shí)，還可以將SPT擴(kuò)展到其他領(lǐng)域，例如化學(xué)、物理等學(xué)科。最近報(bào)道用SPT探究自由基的聚合機(jī)理[98]以及納米材料中的擴(kuò)散、吸收、分配以及測(cè)量的動(dòng)力學(xué)問(wèn)題[99]。了解納米材料合成以及運(yùn)輸機(jī)制可以幫助我們?cè)O(shè)計(jì)出先進(jìn)的材料體系，進(jìn)一步推動(dòng)SPT的進(jìn)步。

參考文獻(xiàn)：

[1] LIPPINCOTT-SCHWARTZ J,SNAPP E,KENWORTHY A. Studying protein dynamics in living cells[J].Nat.Rev.Mol.CellBio.,2001,2(6):444-456.

[2] REITS E A J,NEEFJES J J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells[J].Nat.CellBiol.,2001 3(6):E145-E147.

[3] DOMINGUEZ-MEDINA S,CHEN S,BLANKENBURG J,etal.. Measuring the hydrodynamic size of nanoparticles using fluctuation correlation spectroscopy[J].AnnualReviewofPhysicalChemistry,2016,67:489-514.

[4] YU TA,MARTINEZ MM,PAPPAS D. Fluorescence correlation spectroscopy:a review of biochemical and microfluidic applications[J].AppliedSpectroscopy,2011,65(4):115a-124a.

[5] SPRAGUE B L,PEGO R L,STAVREVA DA,etal.. Analysis of binding reactions by fluorescence recovery after photobleaching[J].BiophysicalJournal,2004,86(6):3473-3495.

[6] ELSON E L. Fluorescence correlation spectroscopy:past, present, future[J].BiophysicalJournal,2011,101(12):2855-2870.

[7] HAUSTEIN E,SCHWILLE P. Fluorescence correlation spectroscopy:novel variations of an established technique[J].AnnualReviewofBiophysicsandBiomolecularStructure,2007,36:151-169.

[8] GEERTS H,DE BRABANDER M,NUYDENS R,etal.. Nanovid tracking:a new automatic method for the study of mobility in living cells based on colloidal gold and video microscopy[J].BiophysicalJournal,1987,52(5):775-782.

[9] DE BRABANDER M,NUYDENS R,GEERTS H,etal.. Dynamic behavior of the transferrin receptor followed in living epidermoid carcinoma(A431) cells with nanovid microscopy[J].CellMotilityandtheCytoskeleton,1988,9(1):30-47.

[10] DE BRABANDER M,NUYDENS R,ISHIHARA A,etal.. Lateral diffusion and retrograde movements of individual cell surface components on single motile cells observed with Nanovid microscopy[J].TheJournalofCellBiology,1991,112(1):111-124.

[11] BETZIG E,CHICHESTER R J. Single molecules observed by near-field scanning optical microscopy[J].Science,1993,262(5138):1422-1425.

[12] SAKO Y,MINOGHCHI S,YANAGIDA T. Single-molecule imaging of EGFR signalling on the surface of living cells[J].NatureCellBiology,2000,2(3):168-172.

[13] IINO R,KOYAMA I,KUSUMI A. Single molecule imaging of green fluorescent proteins in living cells: E-cadherin forms oligomers on the free cell surface[J].BiophysicalJournal,2001,80(6):2667-2677.

[14] SCHMIDT T,SCHUTZ GJ,BAUMGARTNER W,etal.. Imaging of single molecule diffusion[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1996,93(7):2926-2929.

[15] SCHUTZ G J,KADA G,PASTUSHENKO V P,etal.. Properties of lipid microdomains in a muscle cell membrane visualized by single molecule microscopy[J].TheEMBOJournal,2000,19(5):892-901.

[16] DAHAN M,LEVI S,LUCCARDINI C,etal.. Diffusion dynamics of glycine receptors revealed by single-quantum dot tracking[J].Science,2003,302(5644):442-445.

[17] KUSUMI A,SUZUKI K G,KASAI R S,etal.. Hierarchical mesoscale domain organization of the plasma membrane[J].TrendsinBiochemicalSciences,2011,36(11):604-615.

[18] WARSHAW D M,KENNEDY G G,WORK S S,etal.. Differential labeling of myosin V heads with quantum dots allows direct visualization of hand-over-hand processivity[J].BiophysicalJournal,2005,88(5):L30-32.

[19] NAN X,SIMS P A,CHEN P,etal.. Observation of individual microtubule motor steps in living cells with endocytosed quantum dots[J].TheJournalofPhysicalChemistryB,2005,109(51):24220-24224.

[20] COURTY S,LUCCARDINI C,BELLAICHE Y,etal.. Tracking individual kinesin motors in living cells using single quantum-dot imaging[J].NanoLetters,2006,6(7):1491-1495.

[21] BIERMANN B,SOKOLL S,KLUEVA J,etal.. Imaging of molecular surface dynamics in brain slices using single-particle tracking[J].NatureCommunications,2014,5.

[22] NAM S H,BAE Y M,PARK Y I,etal.. Long-term real-time tracking of lanthanide ion doped upconverting nanoparticles in living cells[J].AngewandteChemie,2011,50(27):6093-6097.

[23] KURAL C,KIM H,SYED S,etal.. Kinesin and dynein move a peroxisomeinvivo:a tug-of-war or coordinated movement?[J].Science,2005,308(5727):1469-1472.

[24] YILDIZ A,FORKEY J N,MCKINNEY S A,etal.. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization[J].Science,2003,300(5628):2061-2065.

[25] CHEN K,GU Y,SUN W,etal.. Characteristic rotational behaviors of rod-shaped cargo revealed by automated five-dimensional single particle tracking[J].NatureCommunications,2017,8(1):887.

[26] CHEEZUM M K,WALKER W F,GUILFORD W H. Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles[J].BiophysicalJournal,2001,81(4):2378-2388.

[27] SHEN H,TAUZIN L J,BAIYASI R,etal.. Single particle tracking:from theory to biophysical applications[J].ChemicalReviews,2017,117(11):7331-7376.

[28] MANZO C,GARCIA-PARAJO M F. A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights[J].ReportsonProgressinPhysics.PhysicalSociety,2015,78(12):124601.

[29] SERGE A,BERTAUX N,RIGNEAULT H,etal.. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes[J].NatureMethods,2008,5(8):687-694.

[30] SAXTON M J,JACOBSON K. Single-particle tracking: applications to membrane dynamics[J].AnnualReviewofBiophysicsandBiomolecularStructure,1997,26:373-399.

[31] DEAN K M,PALMER A E. Advances in fluorescence labeling strategies for dynamic cellular imaging[J].NatureChemicalBiology,2014,10(7):512-523.

[32] FERNANDEZ-SUAREZ M,TING A Y. Fluorescent probes for super-resolution imaging in living cells[J].NatureReviews.MolecularCellBiology,2008,9(12):929-943.

[33] SHEETZ M P,TURNEY S,QIAN H,etal.. Nanometre-level analysis demonstrates that lipid flow does not drive membrane glycoprotein movements[J].Nature,1989,340(6231):284-288.

[34] GARCIA-PARAJO M F,SEGERS-NOLTEN G M,VEERMAN J A,etal.. Real-time light-driven dynamics of the fluorescence emission in single green fluorescent protein molecules[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2000,97(13):7237-7242.

[35] BRUCHEZ M J R,MORONNE M,GIN P,etal. Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels[J].Science,1998,281(5385):2013-2016.

[36] YAO J,LARSON D R,VISHWASRAO H D,etal.. Blinking and nonradiant dark fraction of water-soluble quantum dots in aqueous solution[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2005,102(40):14284-14289.

[37] DERFUS A M,CHAN W C W,BHATIA S N. Probing the cytotoxicity of semiconductor quantum dots[J].NanoLetters,2004,4(1):11-18.

[38] MIAO P,HAN K,TANG Y G,etal.. Recent advances in carbon nanodots: synthesis, properties and biomedical applications[J].Nanoscale,2015,7(5):1586-1595.

[39] MIAO P,TANG Y G,HANA K,etal.. Facile synthesis of carbon nanodots from ethanol and their application in ferric(III) ion assay[J].J.Mater.Chem.A,2015,3(29):15068-15073.

[40] CHANG Y R,LEE H Y,CHEN K,etal.. Mass production and dynamic imaging of fluorescent nanodiamonds[J].NatureNanotechnology,2008,3(5):284-288.

[41] FU C C,LEE H Y,CHEN K,etal.. Characterization and application of single fluorescent nanodiamonds as cellular biomarkers[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2007,104(3):727-732.

[42] JIN H,HELLER D A,STRANO M S. Single-particle tracking of endocytosis and exocytosis of single-walled carbon nanotubes in NIH-3T3 cells[J].NanoLetters,2008,8(6):1577-1585.

[43] JIN H,HELLER D A,SHARMA R,etal. Size-dependent cellular uptake and expulsion of single-walled carbon nanotubes: single particle tracking and a generic uptake model for nanoparticles[J].ACSNano,2009,3(1):149-158.

[44] WU S,HAN G,MILLIRON D J,etal.. Non-blinking and photostable upconverted luminescence from single lanthanide-doped nanocrystals[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2009,106(27):10917-10921.

[45] BAE Y M,PARK Y I,NAM S H,etal.. Endocytosis, intracellular transport, and exocytosis of lanthanide-doped upconverting nanoparticles in single living cells[J].Biomaterials,2012,33(35):9080-9086.

[46] WANG F,HAN Y,LIM C S,etal.. Simultaneous phase and size control of upconversion nanocrystals through lanthanide doping[J].Nature,2010,463(7284):1061-1065.

[47] LIU X J,TU Y,GAI H W. Imaging of single molecules by wide-field optical microscopy[J].Prog.Chem.,2013,25(2-3):370-379.

[48] MICHALET X,COLYER R A,SCALIA G,etal.. Development of new photon-counting detectors for single-molecule fluorescence microscopy[J].Philos.T.R.Soc.B,2013,368(1611)

[49] WIESER S,SCHUTZ G J. Tracking single molecules in the live cell plasma membrane-Do′s and Don′t′s[J].Methods,2008,46(2):131-140.

[50] MICHALET X,SIEGMUND O H W,VALLERGA J V,etal.. Detectors for single-molecule fluorescence imaging and spectroscopy[J].J.Mod.Optic,2007,54(2-3):239-281.

[51] AXELROD D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology[J].Traffic,2001,2(11):764-774.

[52] TOKUNAGA M,IMAMOTO N,SAKATA-SOGAWA K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells[J].NatureMethods,2008,5(2):159-161.

[53] STENDER A S,MARCHUK K,LIU C,etal.. Single cell optical imaging and spectroscopy[J].ChemicalReviews,2013,113(4):2469-2527.

[54] ARHEL N,GENOVESIO A,KIM K A,etal.. Quantitative four-dimensional tracking of cytoplasmic and nuclear HIV-1 complexes[J].NatureMethods,2006,3(10):817-824.

[55] LANGE S,KATAYAMA Y,SCHMID M,etal.. Simultaneous transport of different localized mRNA species revealed by live-cell imaging[J].Traffic,2008,9(8):1256-1267.

[56] MANLEY S,GILLETTE J M,PATTERSON G H,etal.. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy[J].NatureMethods,2008,5(2):155-157.

[57] PASZEK M J,DUFORT C C,ROSSIER O,etal.. The cancer glycocalyx mechanically primes integrin-mediated growth and survival[J].Nature,2014,511(7509):319-325.

[58] ROSSIER O,OCTEAU V,SIBARITA J B,etal.. Integrins beta1 and beta3 exhibit distinct dynamic nanoscale organizations inside focal adhesions[J].NatureCellBiology,2012,14(10):1057-1067.

[59] GIANNONE G,HOSY E,LEVET F,etal.. Dynamic superresolution imaging of endogenous proteins on living cells at ultra-high density[J].BiophysicalJournal,2010,99(4):1303-1310.

[60] GARCIA-PARAJO M F,CAMBI A,TORRENO-PINA J A,etal.. Nanoclustering as a dominant feature of plasma membrane organization[J].JournalofCellScience,2014,127(Pt 23):4995-5005.

[61] LINGWOOD D,SIMONS K. Lipid rafts as a membrane-organizing principle[J].Science,2010,327(5961):46-50.

[62] KUSUMI A,TSUNOYAMA T A,HIROSAWA K M,etal.. Tracking single molecules at work in living cells[J].NatureChemicalBiology,2014,10(7):524-532.

[63] KUSUMI A,NAKADA C,RITCHIE K,etal.. Paradigm shift of the plasma membrane concept from the two-dimensional continuum fluid to the partitioned fluid: high-speed single-molecule tracking of membrane molecules[J].AnnualReviewofBiophysicsandBiomolecularStructure,2005,34:351-378.

[64] SAKO Y,KUSUMI A. Barriers for lateral diffusion of transferrin receptor in the plasma membrane as characterized by receptor dragging by laser tweezers:fence versus tether[J].TheJournalofCellBiology,1995,129(6):1559-1574.

[65] FUJIWARA T,RITCHIE K,MURAKOSHI H,etal.. Phospholipids undergo hop diffusion in compartmentalized cell membrane[J].TheJournalofCellBiology,2002,157(6):1071-1081.

[66] SUZUKI K G,KASAI R S,HIROSAWA K M,etal.. Transient GPI-anchored protein homodimers are units for raft organization and function[J].NatureChemicalBiology,2012,8(9):774-783.

[67] ANDREWS N L,LIDKE K A,PFEIFFER J R,etal.. Actin restricts FcepsilonRI diffusion and facilitates antigen-induced receptor immobilization[J].NatureCellBiology,2008,10(8):955-963.

[68] OWEN D M,WILLIAMSON D,RENTERO C,etal.. Quantitative microscopy: protein dynamics and membrane organisation[J].Traffic,2009,10(8):962-971.

[69] TREANOR B,DEPOIL D,GONZALEZ-GRANJA A,etal.. The membrane skeleton controls diffusion dynamics and signaling through the B cell receptor[J].Immunity,2010,32(2):187-199.

[70] MURASE K,FUJIWARA T,UMEMURA Y,etal.. Ultrafine membrane compartments for molecular diffusion as revealed by single molecule techniques[J].BiophysicalJournal,2004,86(6):4075-4093.

[71] WIESER S,MOERTELMAIER M,FUERTBAUER E,etal.. (Un)confined diffusion of CD59 in the plasma membrane determined by high-resolution single molecule microscopy[J].BiophysicalJournal,2007,92(10):3719-3728.

[72] WEGNER K D,HILDEBRANDT N. Quantum dots: bright and versatileinvitroandinvivofluorescence imaging biosensors[J].Chem.Soc.Rev.,2015,44(14):4792-4834.

[73] LEDUC C,SI S,GAUTIER J,etal.. A highly specific gold nanoprobe for live-cell single-molecule imaging[J].NanoLetters,2013,13(4):1489-1494.

[74] TAURAN Y,BRIOUDE A,COLEMAN A W,etal.. Molecular recognition by gold, silver and copper nanoparticles[J].WorldJournalofBiologicalChemistry,2013,4(3):35-63.

[75] LIDKE DS,LIDKE KA,RIEGER B,etal.. Reaching out for signals:filopodia sense EGF and respond by directed retrograde transport of activated receptors[J].TheJournalofCellBiology,2005,170(4):619-626.

[76] RAJAN S S,LIU H Y,VU T Q. Ligand-bound quantum dot probes for studying the molecular scale dynamics of receptor endocytic trafficking in live cells[J].ACSNano,2008,2(6):1153-1166.

[77] BHATIA D,ARUMUGAM S,NASILOWSKI M,etal.. Quantum dot-loaded monofunctionalized DNA icosahedra for single-particle tracking of endocytic pathways[J].NatureNanotechnology,2016,11(12):1112-1119.

[78] PIEROBON P,ACHOURI S,COURTY S,etal.. Velocity, processivity, and individual steps of single myosin V molecules in live cells[J].BiophysicalJournal,2009,96(10):4268-4275.

[79] FAKHRI N,WESSEL A D,WILLMS C,etal.. High-resolution mapping of intracellular fluctuations using carbon nanotubes[J].Science,2014,344(6187):1031-1035.

[80] BALINT S,VERDENY V I,SANDOVAL A A,etal. Correlative live-cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2013,110(9):3375-3380.

[81] APPELHANS T,RICHTER C P,WILKENS V,etal.. Nanoscale organization of mitochondrial microcompartments revealed by combining tracking and localization microscopy[J].NanoLetters,2012,12(2):610-616.

[82] YOO J,KAMBARA T,GONDA K,etal.. Intracellular imaging of targeted proteins labeled with quantum dots[J].ExperimentalCellResearch,2008,314(19):3563-3569.

[83] VALM A M,COHEN S,LEGANT W R,etal.. Applying systems-level spectral imaging and analysis to reveal the organelle interactome[J].Nature,2017,546(7656):162-167.

[84] MISTELI T. Beyond the sequence: cellular organization of genome function[J].Cell,2007,128(4):787-800.

[85] HANDWERGER K E,GALL J G. Subnuclear organelles: new insights into form and function[J].TrendsinCellBiology,2006,16(1):19-26.

[86] VIVANTE A,BROZGOL E,BRONSHTEIN I,etal.. Genome organization in the nucleus:from dynamic measurements to a functional model[J].Methods,2017,123:128-137.

[87] LEVI V,RUAN Q,PLUTZ M,etal.. Chromatin dynamics in interphase cells revealed by tracking in a two-photon excitation microscope[J].BiophysicalJournal,2005,89(6):4275-4285.

[88] GEBHARDT J C,SUTER DM,ROY R,etal. Single-molecule imaging of transcription factor binding to DNA in live mammalian cells[J].NatureMethods,2013,10(5):421-426.

[89] LOWE A R,SIEGEL J J,KALAB P,etal.. Selectivity mechanism of the nuclear pore complex characterized by single cargo tracking[J].Nature,2010,467(7315):600-603.

[90] LIU H B,LIU Y,LIU S L,etal.. Clathrin-mediated endocytosis in living host cells visualized through quantum dot labeling of infectious hematopoietic necrosis virus[J].J.Virol.,2011,85(13):6252-6262.

[91] WEN L,LIN Y,ZHENG ZH,etal.. Labeling the nucleocapsid of enveloped baculovirus with quantum dots for single-virus tracking[J].Biomaterials,2014,35(7):2295-2301.

[92] LV C,LIN Y,LIU A A,etal.. Labeling viral envelope lipids with quantum dots by harnessing the biotinylated lipid-self-inserted cellular membrane[J].Biomaterials,2016,106:69-77.

[93] JOO K I,FANG Y,LIU Y,etal.. Enhanced real-time monitoring of adeno-associated virus trafficking by virus-quantum dot conjugates[J].ACSNano,2011,5(5):3523-3535.

[94] LIU S L,ZHANG Z L,TIAN Z Q,etal.. Effectively and efficiently dissecting the infection of influenza virus by quantum-dot-based single-particle tracking[J].ACSNano,2012,6(1):141-150.

[95] LI Q,LI W,YIN W,etal.. Single-particle tracking of human immunodeficiency virus type 1 productive entry into human primary macrophages[J].ACSNano,2017,11(4):3890-3903.

[96] YU J,ZHANG X J,HAO X J,etal.. Near-infrared fluorescence imaging using organic dye nanoparticles[J].Biomaterials,2014,35(10):3356-3364.

[97] NI M,ZHUO S,SO P T,etal.. Fluorescent probes for nanoscopy:four categories and multiple possibilities[J].JournalofBiophotonics,2017,10(1):11-23.

[98] NOLLE J M,PRIMPKE S,MULLEN K,etal.. Diffusion of single molecular and macromolecular probes during the free radical bulk polymerization of MMA-towards a better understanding of the Trommsdorff effect on a molecular level[J].Polym.Chem.-Uk,2016,7(24):4100-4105.

[99] HIGGINS D A,PARK S C,TRAN-BA K H,etal.. Single-molecule investigations of morphology and mass transport dynamics in nanostructured materials[J].Annu.Rev.Anal.Chem.,2015,8:193-216.