長時程雙光子成像技術

徐依雯，張運海，楊皓旻，劉 創，唐玉國

(1.中國科學院 蘇州生物醫學工程技術研究所，江蘇省醫用光學重點實驗室，江蘇 蘇州 215163；2.中國科學院大學，北京 100049)

1 引 言

雙光子顯微鏡是非線性光學顯微鏡中應用最廣泛的一種[1]，在雙光子熒光顯微鏡成像時，熒光分子必須同時吸收兩個長波長光子才能達到激發態，然后發射出一個波長較短的光子，實現成像[2]，因此雙光子成像對激發光的光子密度要求很高，只有焦點及其附近非常小體積內的熒光分子能夠被激發，這種激發特性使得雙光子具有極高的三維分辨率[3-4]。由于雙光子采用近紅外波段的激發光，波長較長，穿透性好，在某些生物樣本如血管中成像深度甚至能超過1 mm[5]，對細胞的光毒性也小，非常適合用來觀察活細胞甚至活組織[6]。雙光子顯微鏡因其低光毒性、大成像深度和高三維分辨率的優勢成為生物醫學及藥學領域重要的研究工具[7-8]，被廣泛用于神經、血管以及腫瘤等相關方面的研究[9-11]。

在雙光子顯微成像中，雖然長波長光的光毒性較弱，光漂白也局限于焦點處，但是由于高數值孔徑物鏡和窄激光脈寬等原因，聚焦光斑處光功率密度極高，焦平面的熒光分子仍然會發生嚴重的熒光漂白[12]。Alexander Hopt等人的研究表明，激光造成的光損傷與激光脈沖寬度成反比，即激光脈寬越窄，對熒光分子的光損傷越大[13]。雙光子成像為了保證激光光子密度，通常采用飛秒激光器作為光源，脈寬幾百飛秒的短脈沖激光會帶來非常嚴重的熒光漂白，影響了雙光子長時間成像所取得的熒光圖像質量，研究降低雙光子成像時熒光漂白的技術顯得十分重要。

熒光團發射熒光時必然伴隨熒光漂白，漂白過程的快慢及嚴重程度取決于熒光團本身的光學化學性質以及光照劑量，從這兩點出發，有許多限制光漂白的方法，比如改進培養基以減少背景熒光從而降低激發光強[14]，再比如減少樣本氧氣含量以減少氧化物的產生，或者添加化學穩定劑提高熒光團抗漂白能力[15]等。從成像技術角度來說，直接減少光照劑量是緩解熒光漂白問題最直接有效的途徑。減少光劑量并不意味著直接降低光強或縮短照明時間，否則無法獲取足夠的有效熒光信號，所取圖像變得模糊。Manders等人提出一種單光子共聚焦閉環控制技術CLEM[16]，對不同濃度的熒光團施加不同的光劑量，最大限度降低了單光子共聚焦成像的熒光漂白，但其閉環循環條件是根據多次實驗經驗得出的，對于不同的樣本需要重新實驗摸索。

本文提出了一種降低熒光漂白的雙光子成像新技術——優化光照的雙光子(Optimized Lighting-Two Photon,OL-TP)成像技術。利用預掃描取得的傳統雙光子圖像，分析高低閾值，并以此閾值為標準，優化雙光子成像時同一幅圖像上不同區域的光照時間，在保證信噪比的同時降低熒光漂白。

2 優化光照的雙光子原理與實現方法

2.1 優化光照的原理

雙光子成像對激光光子密度要求很高，極高的光子流量大大提高了雙光子成像焦點范圍內熒光分子與光子發生相互作用的概率[17]。Patterson等人的研究表明，雙光子激發的熒光漂白率與激發光入射光強成高階指數關系，而單光子激發的熒光漂白率與入射光強成線性關系，雙光子成像對焦平面的熒光漂白遠超單光子成像[18]。以作用于樣本激光功率3～5 mW(生物成像典型光功率)為例，當雙光子激光脈寬為150 fs時，對焦平面而言，雙光子成像造成的熒光漂白是單光子的10倍[18]。激發光強和光照時間是雙光子熒光漂白的主要影響因素，所以通過優化光照來降低雙光子熒光漂白的方法具有很大的可行性。

雙光子熒光顯微成像系統與共聚焦激光掃描顯微鏡[19]類似，屬于點掃描成像系統，激光經物鏡聚焦后只能激發焦點附近一小片區域的熒光，以焦平面光斑與樣本相對位移收集熒光信號并獲取圖像，常用點擴散函數[20](Point Spread Function,PSF)描述掃描樣本的光斑，其直徑可由式(1)計算：

(1)

本文實驗中使用的激發光波長λ=780 nm，數值孔徑NA=1.4，光斑直徑d=660 nm，根據奈奎斯特采樣定律，采樣頻率達到信號最高頻率的兩倍才能完整保留原始信號中的信息，實際應用中應大于兩倍，所以本文實驗中將采樣間隔(物方像素尺寸)設為60 nm。由于焦點光斑的直徑遠大于像素尺寸，光斑停留在某一個像素內時，周圍多個像素都處于光斑照射范圍內。

傳統雙光子成像技術，激光光強恒定，成像區域內各點的光照時間完全相同，所以激光強度必須合理設置，既不能太強也不能太弱，太強會使熒光分子密集區域熒光過強，引發熒光飽和以及嚴重的光漂白，太弱則會使熒光分子稀疏區域熒光過弱，無法在圖像上清晰呈現。在長時程成像時，考慮熒光漂白的影響，一般會調整激光強度使細節部分恰好能看清。這就意味著，對熒光分子稀疏區域正合適的光照時間，在熒光分子密集區域會產生過量的熒光信號，在圖像上表現為局部高信噪比，如圖1(a)所示；而在沒有熒光分子的背景區域完全無法獲得有效熒光信號，反而對周邊在光斑照射范圍內的熒光分子造成漂白，如圖1(b)所示。

圖1 物方像素點掃描示意圖 Fig.1 Spot scanning diagram of objective pixel

生物樣本中熒光分子分布很不均勻，光照時間過剩的情況普遍存在，本文提出的優化光照的雙光子成像方法，不改變激光強度，只在無熒光分子的背景區和熒光分子很密的強熒光區減少光照時間，從而大幅減少不必要的熒光漂白，同時又保證圖像信噪比不會降低太多。

2.2 優化光照的雙光子成像技術實現方法

優化光照時間的雙光子成像方法基本思想是：分析閾值，以閾值為標準優化各像素光照時間以去除不必要光照。

首先，利用預掃描獲取傳統雙光子圖像，分析出高低兩個閾值。高閾值是圖像上每個像素內熒光信號必須達到的信噪比要求的下限，為了判斷出位于熒光分子密集區域的像素而設置的。高閾值計算公式如式(2)所示：

(2)

式(2)中，Iu表示高閾值，I5%max為傳統雙光子圖像中最大5%像素值的均值，Td表示判斷時間，Tp表示像素停留時間。

低閾值是噪聲信號的上限，為了分辨不產生熒光信號的背景區域像素而設置。低閾值計算公式如式(3)所示：

(3)

式(3)中，Il表示低閾值，I5%min為傳統雙光子圖像中最小5%像素值的均值，Td表示判斷時間，Tp表示像素停留時間，IN為環境噪聲最大值。

然后，在每個像素掃描過程中不斷讀取反饋的像素值，并與閾值比較。根據比較結果優化各像素光照時間。每個像素開始掃描時刻記為0，首次讀取反饋的時間稱為判斷時間，記為Td；掃描光斑中心位置停留在單個像素的時間稱為像素停留時間，記為Tp；激光實際保持開啟的時間稱為像素實際光照時間，記為Te。

當激光開始掃描一個像素，先用一小段時間(判斷時間)收集熒光信息，然后開始讀取反饋并判斷該像素所在區域以及是否需要優化光照時間，如圖2所示：當反饋小于低閾值，判斷該像素位于背景區域，立刻關閉激光；當反饋大于高閾值，判斷該像素位于熒光分子密集區域，也立刻關閉激光；當反饋始終在高低閾值之間，判斷該像素位于熒光分子稀疏區域，需接受標準時長的光照。

圖2 OL-TP像素光照時間優化過程示意圖 Fig.2 Diagram of optimized process for pixel lighting time in OL-TP

2.3 優化光照的雙光子重建圖像

以OL-TP方法掃描一幅圖像后得到兩組數據，一組數據代表了每個像素實際接受光照的時長，另一組數據代表了每個像素實際采集到的像素值。像素值與光照時間成線性關系，如圖3所示，I表示過程中像素值(反饋)，Ie表示實際像素值，對應實際光照時間Te，Ip表示若該像素接受全程光照應得的等效像素值，對應像素停留時間Tp。

圖3 像素值與像素光照時間關系示意圖 Fig.3 Relationship between pixel value and lighting time

OL-TP重建圖像的原理就是像素值與像素光照時間的線性關系，重建OL-TP圖像的公式如式(4)所示，

(4)

式(4)中，Ip(x,y)為等效像素值，Ie(x,y)為實際像素值，Te(x,y)為像素實際光照時間，Tp(x,y)為像素停留時間。公式比較抽像，圖4用一組四像素示意圖說明重建過程，假設像素停留時間設為200 μs，判斷時間設為50 μs，高閾值設為100，低閾值設為5。

圖4(a)代表傳統雙光子圖像，圖中的數字表示每個像素接受200 μs光照時的像素值；圖4(b)代表像素光照時間分布圖，圖中的數字表示高閾值設為100低閾值設為5時，每個像素實際接受光照的時間，單位為μs；圖4(c)代表實際像素值分布圖，圖中數字表示對應圖4(b)中光照時間的實際像素值；圖4(d)代表重建的OL-TP圖像，圖中數字由圖4(b)和圖4(c)根據式(4)計算得到。理想情況下OL-TP重建圖像與傳統雙光子圖像完全一致。

圖4 (a)傳統雙光子圖像；(b)像素光照時間分布圖；(c)實際像素值分布圖；(d)OL-TP重建圖像 Fig.4 (a)Conventional two-photon image; (b)distribution of pixel lighting time; (c)distribution of real pixel value; (d)reconstructed image of OL-TP

2.4 優化光照的雙光子成像系統

為了實現預設閾值并優化光照時間的功能，OL-TP成像系統比傳統雙光子成像系統增加了兩個部分，一塊FPGA(Field Programmable Gate Array)板配合放大電路構成的反饋電路，以及一個聲光調制器(Acoustic-Optical Modulation，AOM)。AOM放置在光路中，起到高速開關的作用；反饋電路主體是FPGA，用作光子計數器，存儲高低閾值，編入反饋判斷程序，執行比較后根據結果輸出信號，控制AOM實現激光的開閉。探測器采用光子計數型雪崩光電二極管(APD)，型號為SPCM-AQRH-14-FC。系統結構如圖5所示。

圖5 OL-TP成像系統結構示意圖 Fig.5 Diagram of OL-TP image system

3 優化光照的雙光子成像實驗

在驗證OL-TP降漂白效果前，先要驗證OL-TP重建圖像的真實性。圖6(a)是傳統雙光子圖像，圖6(b)是在同一區域獲得的OL-TP重建圖像，需要從主觀和客觀兩個角度對重建圖像保真程度進行評價[21]。

圖6 (a)傳統雙光子圖像。(b)OL-TP重建圖像 Fig.6 (a)Conventional two-photon image. (b)Reconstructed image of OL-TP

主觀評價是由人眼對兩幅圖像進行觀察，其結論是這兩幅圖像相似度很高，差異性很小。客觀圖像質量評價方法很多，全參考評價方法是其中最可靠的評價方法，以傳統雙光子圖像為參考圖像，通過將重建圖像與傳統雙光子圖像進行比較來評價重建圖像的保真程度[22]。最簡單最高效的全參考評價方法就是峰值信噪比(PSNR)，以參考圖像的像素值為信號，待評價圖像也就是重建圖像與參考圖像的像素值差異作為噪聲，計算公式如式(3)所示，

PSNR=10×

(3)

式(3)中，圖像大小為M×N，R(x,y)是參考圖像在(x,y)處的像素值，I(x,y)是重建圖像在(x,y)處的像素值。當峰值信噪比達到30 dB以上，可以判斷噪聲對圖像的影響相當小，也就是兩幅圖像的差異性非常小。以圖6(a)為參考圖像，圖6(b)的PSNR值為39.93 dB，這說明OL-TP重建圖像保真程度較高，只是信噪比略有下降，但未對圖像質量造成很大影響。

為驗證OL-TP成像方法降漂白效果，本文設計了一組實驗：激發光波長為780 nm，顯微鏡物鏡前光強為19 mW，物方像素尺寸為60 nm，成像區域為15 μm×15 μm，判斷時間為50 μs，像素停留時間為200 μs，成像區域內共有250×250個像素，本文實驗中每一行從左向右掃描結束后，位移臺會回到最左邊再開始掃描下一行，換行時間與掃描時間基本相同，掃描時間加上換行時間即為本文實驗中獲取一幅完整圖像所需時間，約25 s。用傳統雙光子和OL-TP分別對110 nm熒光小球樣本連續取30幅圖像，將兩組圖的第一幅和最后一幅圖在同一標尺下作對比，如圖7所示。從圖7可以明顯觀察到，連續掃描30幅圖像之后，傳統雙光子圖像大部分區域變得非常暗，而OL-TP圖像只是整體亮度略有降低，并沒有發生明顯的光漂白現象。

圖7 (a)傳統雙光子。(b)OL-TP重建圖像 Fig.7 (a)Conventional two-photon image. (b)Reconstructed image of OL-TP

本文采用的探測器是光子計數型雪崩光電二極管，探測到的光子數代表了熒光強度，在圖像上表現為各像素的像素值。為了定量分析OL-TP成像方法降漂白的效果，對一幅圖像上所有像素值求和，計算結果代表一幅圖的熒光光子總數。經計算，傳統雙光子組的第30幅圖像熒光光子總數為第1幅圖像的62.94%，而OL-TP組的第30幅圖像熒光光子總數為第1幅圖像的91.8%，證明OL-TP成像技術將熒光漂白降低了28.86%。

4 結 論

本文針對影響雙光子顯微成像技術長時程觀測效果的焦平面熒光漂白問題，提出了一種降低熒光漂白的雙光子成像新技術——優化光照的雙光子(OL-TP)成像技術，它利用掃描前取得的傳統雙光子圖像，針對成像區域設置閾值，并根據所設閾值優化圖像中每個像素接受的光照時間，從而極大地降低雙光子成像時對焦平面熒光分子的光漂白。

實驗證明，OL-TP對110 nm熒光小球樣本連續成30幅圖像后，整幅圖像的熒光漂白相比傳統雙光子圖像降低了28.86%，證明OL-TP成像技術有很好的降漂白效果，它使得雙光子顯微鏡能對成像目標同一深度的平面連續取更多高質量圖像，極大地延長了雙光子顯微鏡有觀測時程，增強了雙光子熒光顯微術在長時程觀測生物樣本方面的優勢。

參考文獻：

[1] CRISAFI F,KUMAR V,PERRI A,etal.. Multimodal nonlinear microscope based on a compact fiber-format laser source[J].SpectrochimicaActaPartAMolecular&BiomolecularSpectroscopy,2017,188:135-140.

[2] DENK W,STRICKLER J H,WEBB W W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy[J].Science,1990,248(4951):73-76.

[3] 李茜.飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像研究[D].哈爾濱:哈爾濱工業大學,2014.

LI Q. Femtosecond laser two-photon fluorescence biological microscopy[D]. Harbin:Harbin Institute of Technology,2014.(in Chinese)

[4] 李奇峰,沙乾坤,王洋,等.基于非線性光學的2PE-STED顯微技術的發展與應用[J].納米技術與精密工程,2015(2):81-89.

LI Q F,SHA Q K,WANG Y,etal.. Development and application of 2PE-STED microscopy based on nonlinear optics[J].NanotechnologyandPrescisionEngineering,2015(2):81-89.(in Chinese)

[5] MILLER D R,JARRETT J W,HASSAN A M,etal.. Deep tissue imaging with multiphoton fluorescence microscopy[J].CurrentOpinioninBiomedicalEngineering,2017,4:32-39.

[6] TSAKANOVA G, ARAKELOVA E, AYVAZYAN V,etal.. Two-photon microscopy imaging of oxidative stress in human living erythrocytes[J].BiomedicalOpticsExpress,2017,8(12):5834-5846.

[7] 熊大曦,劉云,梁永,等.共振掃描顯微成像中的圖像畸變校正[J].光學 精密工程,2015,23(10):2971-2979.

XIONG D X,LIU Y,LIANG Y,etal.. Correction of distortion in microscopic imaging with resonant scanning[J].Opt.PrecisionEng.,2015,23(10):2971-2979.(in Chinese)

[8] 馬軍,田玉順.雙光子熒光影像技術在藥物研發中的應用前景[J].中國現代應用藥學,2016,33(3):381-385.

MA J,TIAN Y SH. Application prospect of two-photon fluorescence imaging technology in drug development[J].ChineseJournalofModernAppliedPharmacy,2016,33(3):381-385.(in Chinese)

[9] 崔權,陳忠云,張智紅，等.多色雙光子成像技術進展[J].激光與光電子學進展,2017(6):10-23.

CUI Q,CHEN ZH Y,ZHANG ZH H,etal.. Recent advances in multicolor two-photon imaging technique[J].Laser&OptoelectronicsProgress,2017,54(6):060002.(in Chinese)

[10] LEFORT C. A review of biomedical multiphoton microscopy and its laser sources[J].JournalofPhysicsDAppliedPhysics,2017,50(42):423001.

[11] TISCHBIREK C H,BIRKNER A,KONNERTH A.Invivodeep two-photon imaging of neural circuits with the fluorescent Ca2+indicator Cal-590[J].JournalofPhysiology,2017,595(10):3097-3105.

[12] 夏偉強,周源,石明.雙光子顯微成像技術的新進展[J].中國醫療器械雜志,2011,35(3):204-208.

XIA W Q,ZHOU Y,SHI M. Advances in two-photon imaging technology[J].ChineseJournalofMedicalInstrumentation,2011,35(3):204-208.(in Chinese)

[13] HOPT A,NEHER E. Highly nonlinear photodamage in two-photon fluorescence microscopy[J].BiophysJ,2001,80(4):2029-2036.

[14] STEPHENS D J,ALLAN V J. Light microscopy techniques for live cell imaging[J].Science,2003,300(5616):82-86.

[15] STAUDT T,ENGLER A,RITTWEGER E,etal.. Far-field optical nanoscopy with reduced number of state transition cycles[J].OpticsExpress,2011,19(6):5644-5657.

[16] HOEBE R A,VAN OVEN C H,GADELLA T W J,etal.. Controlled light-exposure microscopy reduces photobleaching and phototoxicity in fluorescence live-cell imaging[J].Nat.Biotech.,2007,25(2):249-253.

[17] MONDAL P P,DIASPRO A. Reduction of higher-order photobleaching in two-photon excitation microscopy[J].PhysicalReviewEStatisticalNonlinear&SoftMatterPhysics,2007,75(6 Pt 1):061904.

[18] PATTERSON,GEORGE H,DAVID W. Photobleaching in two-photon excitation microscopy[J].BiophysicalJournal,2000,78(4):2159-2162.

[19] 張運海,楊皓旻,孔晨暉.激光掃描共聚焦光譜成像系統[J].光學 精密工程,2014,22(6):1446-1453.

ZHANG Y H,YANG H M,KONG CH H. Spectral imaging system on laser scanning confocal microscopy[J].Opt.PrecisionEng.,2014,22(6):1446-1453.(in Chinese)

[20] EGGELING C,WILLIG K I,SAHL S J,etal.. Lens-based fluorescence nanoscopy[J].QuarterlyReviewsofBiophysics,2015,48(2):178-243.

[21] 張達奇.全參考圖像主觀質量客觀評價算法研究[D].蘇州:蘇州大學,2014.

ZHANG D Q. Research on objective algorithms for full-reference image quality assessment[D]. Soochow:Soochow University,2014.(in Chinese)

[22] 褚江,陳強,楊曦晨.全參考圖像質量評價綜述[J].計算機應用研究,2014,31(1):13-22.

CHU J,CHEN Q,YANG X CH. Review on full reference image quality assessment algorithms[J].ApplicationResearchofComputers,2014,31(1):13-22.(in Chinese)