核酸功能化納米探針在細胞熒光成像中的應用

鄭愛仙，張曉龍，劉小龍

(福建省孟超肝膽技術聯合創新重點實驗室，福建醫科大學 孟超肝膽醫院，福建 福州 350025)

1 引 言

核酸是攜帶遺傳信息的物質，可分為脫氧核糖核酸(DNA)與核糖核酸(RNA)。DNA是遺傳信息儲存、復制和傳遞的重要基礎，RNA則在蛋白質合成過程中起著非常重要的作用。DNA能夠通過沃森-克里克堿基互補配對原則進行雜交，兩條DNA反向平行繞成雙螺旋結構。堿基互補配對具有專一性，堿基A與T配對形成兩個氫鍵，堿基G與C配對形成3個氫鍵。DNA與RNA也可以通過堿基互補配對原則進行雜交，只是RNA中的U取代了T，與A進行堿基配對。核酸既是自然界中廣泛存在的物質，也能夠通過成熟的人工技術合成。由于堿基互補配對的專一性，完全互補的兩條核酸鏈能夠進行穩定雜交，堿基錯配的兩條核酸鏈進行雜交時，其穩定性明顯降低。核酸的這種特征使其能夠用于構建各種核酸探針，從而實現疾病相關核酸分子的生物分析與成像研究。

此外，通過體外篩選技術還可以篩選出具有特殊功能的核酸序列，例如核酸適體和脫氧核酶。核酸適體能夠與蛋白質、小分子、金屬離子、甚至細胞等目標物質進行高親和性和高特異性的結合。脫氧核酶能夠催化各種化學與生物反應，包括切割核酸底物、催化連接核酸等。這些功能性的核酸在生化分析與臨床診斷中發揮著重要作用[1-5]。近年來研究發現，核酸分子也存在一些缺點，例如生理條件下穩定性較低、容易被核酸酶降解、細胞膜通透性較差等。

納米材料是指至少有一維尺寸處于納米級別(0.1～100 nm)或者以它們為基本原件構成的材料。在納米尺寸下，材料具有一些獨特的性質，如表面效應、體積效應、量子尺寸效應、介電限域效應、量子隧道效應等。隨著近年來納米技術的飛快發展，納米材料已被廣泛應用于生物標志物檢測、藥物篩選與輸送、臨床診斷與治療等方面。氧化石墨烯、金納米顆粒、碳納米管等納米材料對熒光染料具有很好的淬滅作用，金屬納米簇、 無機量子點、碳量子點等納米材料具有獨特的熒光性質，可用于輔助構建熒光成像探針，從而進行生物檢測與成像分析。核酸探針與納米材料相結合可實現細胞內相關生物標志物的可視化熒光成像分析，把核酸探針的特異性識別事件轉換成可觀察的熒光信號。而且，納米材料能夠保護負載的核酸探針不被核酸酶降解，并且無需轉染試劑就能運載核酸探針進入細胞，在細胞熒光成像應用上具有很大優勢[6-9]。

本文主要討論核酸功能化納米探針在細胞熒光成像方面的應用，包括反義寡核苷酸功能化納米探針、核酸適體功能化納米探針和脫氧核酶功能化納米探針。其它一些核酸功能化納米探針也可以用于細胞熒光成像分析。例如，利用端粒酶引物構建核酸納米探針，實現癌細胞內端粒酶的特異性熒光成像；利用納米材料負載質粒，通過基因表達熒光蛋白來實現細胞成像。本綜述主要討論反義寡核苷酸功能化納米探針、核酸適體功能化納米探針以及脫氧核酶功能化納米探針在細胞熒光成像應用方面的研究進展。

2 核酸探針的設計原理

分子信標[10]是比較經典的一種核酸探針，由能夠繞成莖-環結構的核酸序列組成，末端分別標記熒光基團和淬滅基團。兩種基團互相靠近，發生熒光共振能量轉移(FRET)使得熒光基團的熒光被淬滅。當目標核酸與環部序列互補使得兩種基團分隔開時，熒光基團的熒光得到恢復，其作用原理見圖1(a)。除了分子信標，核酸序列還可以用于構建其他基于染料熒光淬滅與恢復的線型核酸探針。如圖1(b)所示，當目標核酸不存在時，分別修飾有熒光基團和淬滅基團的兩條核酸鏈互相靠近，熒光基團的熒光被淬滅。當目標核酸存在時，它能夠取代修飾有熒光基團或淬滅基團的核酸鏈，使得熒光基團和淬滅基團分開，體系的熒光得到恢復。對于核酸探針，熒光恢復程度與目標核酸的含量相關，可實現對目標核酸的特異性信號響應。

圖1 (a)分子信標響應原理；(b)線型核酸探針響應原理 Fig.1 (a)Rresponse principle of molecular beacons; (b)Response principle of linear nucleic acid probe

基于淬滅基團構建的核酸探針，其熒光基團的熒光往往不能被完全淬滅，使得信噪比和靈敏度受到一定限制。為提高熒光淬滅效率，從而提高核酸探針應用的靈敏度，金納米顆粒、氧化石墨烯、碳納米管、聚多巴胺納米顆粒等納米材料可以取代原先的淬滅基團，用于構建核酸探針[11-13]。熒光染料標記的核酸探針可以通過共價修飾或者非共價作用修飾于納米材料表面，此時染料的熒光被淬滅。當目標分子存在時，核酸探針與目標分子結合并從納米材料表面脫落，染料的熒光得到恢復。此外，無機量子點、金屬納米簇、 碳量子點等熒光納米材料也可以代替常規的熒光染料分子來構建熒光核酸探針[14-15]。這些納米熒光材料具有光化學穩定性高、抗光漂白能力強、熒光壽命長等優點。

熒光染料標記的核酸探針，包括基于FRET的線型核酸探針、分子信標等，可用于細胞內核酸的可視化熒光成像研究，把核酸探針的特異性識別事件轉換成可觀察的熒光信號[16]。但是，把核酸探針傳輸到細胞內面臨著較大挑戰，一般需要脂質體等轉染試劑的輔助。而且核酸探針在細胞內容易降解從而導致高的背景信號，使其不能與核酸識別事件區分開來。近年來核酸與納米材料相互作用的研究為核酸探針的熒光成像應用提供了新的機會。納米材料與核酸探針相結合，可以保護負載的核酸探針不被核酸酶降解，并且無需轉染試劑就能進入細胞，在細胞熒光成像應用上具有很大優勢。

3 反義寡核苷酸功能化納米探針

天然的反義寡核苷酸是一類序列較短的能夠與基因DNA正義鏈或信使RNA(mRNA)等核酸通過沃森-克里克堿基互補配對原則進行特異性結合的多聚寡核苷酸，能夠通過不同機制影響基因表達。反義寡核苷酸也可以通過人工合成得到，包括反義RNA和反義DNA。反義寡核苷酸也可以參與構建核酸納米探針，從而實現細胞內mRNA、小分子RNA(microRNA/miRNA)等核酸分子的生物分析與成像研究[17]。

例如，Mirkin課題組利用納米金獨特的光學性質構建了核酸功能化納米探針，實現細胞內生存素相關mRNA的可視化成像分析(如圖2(a)所示)。核酸探針包含能夠特異性識別生存素相關mRNA的反義寡核苷酸，通過金-巰鍵共價修飾于納米金表面。納米金對熒光染料分子具有很高的熒光淬滅效率，可以淬滅核酸探針上標記的熒光染料的熒光，使得整個納米探針處于熒光淬滅狀態。目標mRNA存在時，會與核酸探針上的反義寡核苷酸作用，使得修飾有熒光染料的核酸探針離開納米金表面，熒光得到恢復，通過共聚焦熒光顯微鏡可以觀察到明顯的熒光信號[18]。這種核酸功能化納米探針無需轉染試劑就能被細胞攝取，并且能夠保護核酸探針使其不受核酸酶降解。與單純的核酸探針相比，核酸納米探針的非特異性熒光信號也會小很多，更適合用于細胞內核酸的可視化成像分析。

圖2 (a)納米金輔助構建的核酸納米探針用于細胞內mRNA成像[18]；(b)聚多巴胺輔助構建的核酸納米探針用于成像細胞分化相關的miRNA[19]；(c)多色核酸納米探針用于活細胞內腫瘤相關mRNA成像[20]；(d)核酸作為模板合成具有熒光性質的金納米簇并用于細胞成像[21] Fig.2 (a)AuNPs-based nucleic acid nanoprobe for application in intracellular mRNA imaging[18]; (b)polydopamine-based nucleic acid nanoprobe for the imaging of miRNAs in living human mesenchymal stem cells[19]; (c)a multicolor nanoprobe for imaging of tumor-related mRNAs in living cells[20]; (d)nucleic acid based template for the synthesis of fluorescent gold nanoclusters and their application in cell imaging[21]

此外，氧化石墨烯、碳納米管、聚多巴胺納米顆粒等納米材料也具有很高的熒光淬滅能力，可用于構建核酸功能化納米探針，從而實現細胞內目標核酸的熒光成像分析(如圖2(b)所示)。熒光染料標記的單鏈核酸探針可以通過靜電作用或者π-π堆積作用吸附于這些納米材料表面，使得染料熒光處于淬滅狀態。當目標核酸存在時，染料標記的單鏈核酸能夠與目標核酸相互作用，使其與納米材料的作用減弱并從納米材料表面脫落下來，體系熒光得到恢復。這種熒光增強型的核酸探針響應機制也適用于細胞內核酸的熒光成像分析[19]。

值得一提的是，納米材料對多種熒光染料都具有很強的熒光淬滅能力。所以，納米材料能夠同時修飾不同染料標記的核酸探針，從而實現對多種目標分子的同時熒光成像分析。例如，Tang課題組利用納米金輔助構建一種可用于三通道熒光成像的核酸納米探針(如圖2(c)所示)。修飾于納米金表面的3種核酸探針分別修飾羅丹明染料Rh110、花菁染料Cy3和Cy5，能夠識別不同目標核酸。由于染料分子靠近納米金表面，其熒光都處于淬滅狀態。只有當核酸探針對應的目標分子存在時，其修飾的染料分子的熒光才會恢復。該工作可實現細胞內c-myc mRNA、TK1 mRNA和GalNAc-T mRNA等腫瘤相關mRNA的同時成像分析[20]。

此外，無機量子點、金屬納米簇、 碳量子點等熒光納米材料具有獨特的光學性質，也可以代替常規的熒光染料分子來構建熒光成像探針。例如，核酸功能化的碲化鎘量子點(CdTe QDs)可以通過核酸連接到金納米顆粒表面，由于兩者間的FRET作用，量子點的熒光處于淬滅狀態。當目標核酸存在時，通過核酸雜交使得量子點遠離金納米顆粒，其熒光恢復[22]。該類型的核酸納米探針也可以用于細胞內目標物質的成像分析。特殊核酸序列也可以直接作為模板合成具有熒光性質的納米材料，核酸序列設計比較靈活，還可以在其末端添加具有其他功能的核酸序列。例如，Zhu課題組利用富含胞嘧啶的核酸序列作為模板合成具有熒光性質的銀簇(如圖2(d)所示)，并且在模板序列的末端添加核酸適體序列，從而實現特定細胞類型的熒光成像分析[21]。

總的來說，利用納米材料輔助構建核酸納米探針能夠提高核酸探針傳輸進細胞的能力、能夠抵抗細胞內核酸酶的降解、能夠降低成像背景等，在細胞內特定核酸熒光成像方面已有廣泛研究。但是，基于單一熒光強度檢測的成像方法容易受到探針局部分布以及光源和檢測器漂移等的影響。而且熱力學平衡、核酸酶降解、蛋白質結合、谷胱甘肽競爭結合等過程會使單染料標記的核酸探針從納米材料表面脫落，產生假陽性信號，從而降低成像靈敏度[23]。

為實現細胞內目標核酸的高特異性成像分析并解決現有核酸探針存在的容易產生假陽性的問題，Wang課題組構建了一種新型的修飾兩種熒光基團的核酸納米探針，通過FRET原理實現活細胞內特定mRNA的比率熒光成像[23]。如圖3所示，納米金修飾一條核酸識別鏈，與另一條末端分別修飾供體(羥基熒光素，FAM)和受體(羧基四甲基羅丹明，TAMRA)的發夾型核酸探針雜交。當目標核酸不存在時，發夾型核酸探針的發夾結構被打開，其末端修飾的供體與受體處于分離狀態，導致FRET效率比較低，只有供體的熒光能夠被檢測到。當目標核酸存在時，發夾型核酸探針能夠逐漸被目標核酸替換，并從識別鏈上分離出來從而形成發夾結構。此時，供體與受體離得很近，能夠產生高效的FRET，使得受體的熒光能夠被檢測到。FRET比率熒光成像就是同時記錄供體和受體的熒光發射強度，通過兩種波長處的熒光強度的比率變化實現對目標分析物的精確分析。因此，通過計算受體與供體的熒光強度比率變化可實現對目標核酸的定量分析。

圖3 基于FRET的納米探針用于細胞內mRNA檢測：降低假陽性信號并使系統波動影響最小化[23] Fig.3 FRET nanoprobe for intracellular mRNA detection:avoiding false positive signals and minimizing effects of system fluctuations[23]

傳統的核酸探針一般是基于一對一的信號響應機制進行設計，單個目標分析物只能活化單個探針來產生信號。雖然這些核酸探針能夠用于分析高豐度的目標分析物，但是在直接成像活細胞內低豐度目標分析物時仍面臨挑戰，因為其相對低的靈敏度和不充足的信噪比。為實現活細胞內低豐度目標核酸的分析檢測，構建的核酸探針要對目標分析物具有特異性響應功能，并且要具有較高的響應靈敏度。雖然已有許多生物酶輔助信號放大的分析方法可用于細胞外或固定細胞中核酸的分析檢測，但這類方法大多不適合直接用于活細胞內目標核酸的成像分析。為提高成像靈敏度，已有研究者把核酸納米探針與一些基于脫氧核酶或者基于核酸之間自組裝的信號放大方法相結合來實現成像信號放大[24-25]。

圖4 (a)核酸納米探針用于活細胞內miRNA的催化性分子成像[22]；(b)細胞內雜交鏈反應用于放大檢測mRNA[26] Fig.4 (a)Catalytic molecular imaging of miRNA in living cells by nucleic acid nanoprobe[22]; (b)intracellular hybridization chain reaction for the amplification detection of mRNA[26]

例如，Ma課題組構建了一種基于納米材料組裝的成像探針，用于活細胞內癌癥相關miRNA的信號放大成像(如圖4(a)所示)。該成像探針包含納米金以及通過DNA連接到納米金表面的量子點，由于納米金的熒光淬滅作用，量子點的熒光被淬滅。當目標miRNA存在時，單個miRNA分子能夠在染料DNA鏈的輔助下催化解組裝多個量子點，獲得顯著放大的量子點光致發光信號從而實現對目標miRNA的成像分析。這個過程主要是基于熱力學驅動熵增加過程。與傳統的成像探針不同，目標miRNA能夠作為催化劑重復打開DNA連接鏈，獲得較高的成像靈敏度。與傳統的成像探針相比，這種具有信號放大效果的核酸納米探針可以提高3個數量級的成像靈敏度，通過活細胞中miRNA的成像分析可以溫和準確地區分癌細胞和正常細胞[22]。

除了基于熵驅動催化的成像信號放大方法，還有基于雜交鏈反應(HCR)、催化性發夾組裝等核酸自組裝的成像信號放大方法。HCR是研究比較多的一種成像信號放大方法，通過目標分子引發兩種發夾核酸探針進行交替雜交反應并形成一長串帶缺口的雙鏈DNA結構，由此誘導產生檢測信號[27]。例如，Jiang課題組構建了一種基于靜電作用的DNA組裝體，通過HCR實現活細胞內mRNA的超靈敏成像(如圖4(b)所示)。DNA組裝體包含納米金核、陽離子多肽夾層、以及通過靜電組裝的染料分子標記的發夾型DNA外層。發夾型DNA有兩種，分別標記熒光供體(FAM)和熒光受體(TMR)。納米金核不僅能夠作為模板用于陽離子多肽的自組裝，也能夠淬滅核酸探針上標記的熒光染料的熒光。該納米組裝體能夠高效傳輸進入細胞，而且表面靜電吸附的發夾型DNA能夠由目標mRNA引發，通過HCR由納米組裝體中脫離出來。同時，兩種發夾DNA的交替雜交使得熒光供體和受體互相靠近，基于FRET的信號被活化。由于一個目標mRNA就能催化多個發夾DNA進行交替雜交并且活化多份熒光信號，所以該方法能夠實現活細胞內mRNA的超靈敏熒光成像。該方法檢測限可達到皮摩爾水平[26]。此外，脫氧核酶也能夠用于輔助熒光成像信號放大，這部分將在脫氧核酶功能化納米探針部分進行介紹。

4 核酸適體功能化納米探針

核酸適體是由指數富集的配基系統進化技術(SELEX)從隨機序列庫中篩選出來的一條能夠與目標分子高特異性結合的單鏈DNA或RNA分子[28-30]，其篩選過程如圖5所示。核酸適體能夠折疊成特殊的二級或三級結構從而識別目標分子，其目標分子可以是金屬離子、小分子、蛋白質、甚至是整個細胞。與常用的識別元件抗體相比，核酸適體具有諸多優點，包括尺寸小、變性可逆、容易修飾、熱穩定性好、無免疫原性等。

圖5 核酸適體篩選過程[28] Fig.5 Schematic presentation of aptamer selection process[28]

核酸適體是特殊序列的核酸，可用于構建各種對目標分析物具有特異性響應功能的核酸探針。圖6顯示的是不同核酸適體探針的響應原理圖[31]。核酸適體信標與分子信標類似，是由能夠繞成莖-環結構的包含核酸適體序列的核酸組成，其末端分別標記熒光基團和淬滅基團，兩種基團互相靠近從而發生FRET，熒光基團的熒光處于淬滅狀態。當目標分子存在時，核酸適體會與其作用引起構象變化，此時熒光基團和淬滅基團分開，熒光基團的熒光得到恢復。核酸適體可以一半參與構建核酸適體信標，另一半不做任何標記。當目標分子存在時，兩部分核酸適體一起與目標分子作用，核酸適體信標的發夾結構被打開，體系熒光得到恢復(圖6A)。核酸適體也可以完全參與構建核酸適體信標，目標分子存在時直接與核酸適體信標作用，引起核酸適體構象變化，從而使熒光基團和淬滅基團分離，體系熒光得到恢復(圖6B)。核酸適體探針與目標分子結合時一般會有一定的空間構象，其5’端和3’端會互相靠近，所以核酸適體探針也可以完全不改變序列，只在末端修飾熒光基團和淬滅基團，當目標分子存在時，核酸適體會繞成特殊構象，使得兩種基團互相靠近，體系的熒光發生改變(圖6C)。核酸適體也可以用于構建線型核酸探針，例如核酸適體延長序列后與分別標記淬滅基團和熒光基團的兩條核酸鏈雜交。當目標分子與核酸適體結合時，會使其中一條鏈脫落，體系熒光得到恢復(圖6D)。

圖6 不同核酸適體探針的響應原理[31] Fig.6 Response principle of different aptamer probes[31]

此外，核酸適體也可以與納米金、氧化石墨烯、碳納米管、聚多巴胺納米顆粒等具有淬滅效果的納米材料相結合來構建核酸適體探針(圖6E)。當目標分子存在時，核酸適體與目標分子結合形成特殊構象的復合體并從納米材料表面脫落，體系熒光得到恢復。同時，無機量子點、金屬納米簇、 碳量子點等熒光納米材料也可以代替常規的熒光染料分子來構建核酸適體探針。納米材料與核酸適體探針相結合，同樣可以保護負載的核酸適體探針不被核酸酶降解，并且無需轉染試劑就能進入細胞。

圖7 (a)金納米棒輔助構建的核酸適體探針用于癌細胞特異性的成像與治療[37]；(b)核酸適體功能化納米探針用于線粒體釋放的細胞色素C的熒光成像[38]；(c)AS1411核酸適體與反義寡核苷酸同時功能化的納米顆粒用于癌細胞內microRNA-221熒光成像[39] Fig.7 (a)Gold nanorods based aptamer switch probes for cancer cell specific imaging and treatment[37]; (b)fluorescence imaging of cytochrome c released from mitochondria using aptameric nanoprobe[38]; (c)fluorescence imaging of microRNA-221 in cancer cells by using nucleolin aptamer and antisense oligonucleotides functionalized nanoparticles[39]

近年來，核酸適體已被廣泛應用于癌癥識別、診斷、藥物傳輸與治療等方面[32-36]。例如，Tan課題組利用金納米棒輔助構建核酸適體探針并用于癌細胞特異性響應的熒光成像與治療(如圖7(a)所示)。核酸適體sgc8能夠特異性識別細胞膜蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)，該蛋白過表達于癌細胞CCRF-CEM(急性淋巴細胞白血病T細胞)。把sgc8核酸適體設計成發夾結構，一端修飾巰基，另一端修飾FAM熒光染料或者二氫卟吩e6(Ce6)光敏劑。該核酸適體探針通過金巰鍵修飾于金納米棒表面，此時熒光染料或光敏劑靠近金納米棒表面，染料的熒光處于淬滅狀態。當癌細胞表面過表達的目標蛋白存在時，核酸適體與其結合后構象會發生變化，使得熒光染料或光敏劑遠離金納米棒表面，其熒光得到恢復；并且用不同細胞研究了核酸適體的特異性響應情況，包括目標癌細胞CCRF-CEM和作為對照的Ramos細胞(急性淋巴細胞白血病B細胞)。從流式細胞實驗結果可以發現，目標CCRF-CEM細胞可以檢測到很強的熒光信號，而Ramos細胞的熒光信號很弱；作者還用其他核酸序列取代核酸適體進行研究，發現不管是目標癌細胞還是作為參照的Ramos細胞，它們的熒光信號都很弱。這些結果可以說明，核酸適體功能化納米探針可以通過核酸適體對癌細胞膜表面過表達目標蛋白的特異性響應來實現對癌細胞的特異性熒光成像[37]。

核酸適體不僅能夠用于特異性識別細胞膜表面過表達的目標分子，也能夠用于特異性識別細胞內部的目標分子，從而實現特異性熒光成像。例如，Li課題組利用核酸適體與氧化石墨烯構建了一種核酸適體納米傳感器并用于凋亡細胞中線粒體釋放的細胞色素C的熒光成像研究(如圖7(b)所示)。作者把熒光染料修飾的能夠特異性識別細胞色素C的核酸適體組裝于聚乙二醇修飾的氧化石墨烯上。由于氧化石墨烯對熒光染料具有很高的熒光淬滅效率，所以整個納米組裝體的熒光信號很弱。聚乙二醇修飾的目的是使納米組裝體被腫瘤細胞吞噬后進入細胞質但不會進入線粒體。納米組裝體與細胞色素C的空間分離會使背景熒光信號更低。細胞色素C是細胞凋亡的主要介質，細胞凋亡會使線粒體釋放出細胞色素C。此時，納米組裝體上的核酸適體會與細胞色素C作用，從而從氧化石墨烯上脫落下來，核酸適體修飾的熒光染料的熒光得到恢復。該成像探針能夠直接成像細胞內細胞色素C的遷移事件[38]。此外，核酸適體功能化納米探針也可以用于細胞內其他目標分析物的成像分析。核酸適體本身是特殊序列的核酸，不同序列的核酸適體能夠識別不同的目標分子。簡單改變核酸序列，構建的核酸適體功能化納米探針就能夠用于其他目標分子的成像研究。

核酸適體不僅能夠用于構建生物標志物特異性響應的成像探針，也能夠單純作為癌細胞靶向探針，通過核酸適體與癌細胞過表達的生物分子的特異性結合來提高核酸適體功能化納米探針在癌細胞中的富集，從而減小核酸納米探針的使用劑量并減小其對正常細胞的影響。例如，Kim課題組構建了一種AS1411核酸適體與反義寡核苷酸同時功能化的核酸納米探針并用于癌細胞內miR-221的特異性熒光成像(如圖7C所示)。AS1411核酸適體能夠特異性識別核仁蛋白，使得核酸適體功能化納米探針能夠靶向傳輸到高表達核仁蛋白的癌細胞中。當癌細胞過表達miR-221時，反義寡核酸鏈能夠與其作用使得探針上標記的熒光基團和淬滅基團分開，熒光基團的熒光得到恢復，從而實現對目標miR-221的熒光成像分析[39]。作者考察了15種癌細胞，包括U-87MG(膠質母細胞瘤)、PC-12(腎上腺/嗜酸性細胞瘤)、F11(神經母細胞瘤)、C6(星形細胞瘤)、HepG-2(肝細胞癌)、SK-Hep-1(肝細胞癌)、Caco-2(結腸腺癌)、CT-26(結腸腺癌)、TPC-1(乳頭狀甲狀腺癌)、NPA(乳頭狀甲狀腺癌)、U-20S(成骨肉瘤)、HeLa(宮頸癌)、A549(非小細胞肺癌)、PC-3(前列腺癌)和F9(睪丸畸胎瘤)，以及6種正常細胞，包括MSC(間充質干細胞)、F3(神經元干細胞)、CHO(卵巢細胞)、293(腎上皮細胞)、L132(肺上皮細胞)和TM-4(Sertoli細胞)。這些細胞分別加核酸納米探針后在4 ℃孵育30 min。結果發現，其中的13種癌細胞能夠觀察到很強的熒光信號，但是6種健康細胞觀察不到明顯的熒光信號。如果把核酸適體上的G堿基替換成C堿基，那么不管癌細胞還是正常細胞，都觀察不到明顯的熒光信號。這些結果說明核酸適體功能化納米探針能夠通過核酸適體靶向傳輸到許多不同的癌細胞中，從而提高成像特異性。總的來說，核酸適體功能化納米探針不僅能夠用于核酸適體特異性識別的目標分子的熒光成像分析，也能夠單純作為癌細胞靶向探針，提高核酸適體功能化納米探針在癌細胞內的富集，并實現癌細胞內其他目標分析物的熒光成像分析。

5 脫氧核酶功能化納米探針

圖8 (a)脫氧核酶體外篩選過程；(b)脫氧核酶的結構與切割位點[42]；(c)目標核酸誘導活性脫氧核酶的形成[43]；(d)核酸適體與目標分子結合誘導活性脫氧核酶的形成[44] Fig.8 (a)Schematic presentation of DNAzyme selection process; (b)structure of DNAzyme and the RNA cleavage site[42]; (c)target nucleic acid induced the formation of an active DNAzyme[43]; (d)binding of aptamer to target molecule induced the formation of an active DNAzyme[44]

脫氧核酶主要由3部分組成，活性位點、結合臂和酶催化區域(如圖8(b)所示)。在不影響脫氧核酶功能的情況下，兩個結合臂區域以及其他非必須的核酸序列可以進行修改或修飾，使得脫氧核酶可用于輔因子或其他目標分子特異性響應的分析與成像研究。如圖8(c)所示，可以把脫氧核酶序列分割成兩部分，它們分別包含一部分結合臂和一部分酶催化區域。只有當目標核酸存在時，通過核酸雜交才可以把酶催化區域組裝起來，當輔因子存在時進一步切割核酸底物來產生可檢測信號[43]。脫氧核酶也可以在序列中間直接添加一段具有識別功能的核酸序列來構建脫氧核酶探針。如圖8(d)所示，可以在脫氧核酶中間添加核酸適體，當目標分子不存在時，脫氧核酶被分隔成沒有催化活性的兩段，不能切割核酸底物。當目標分子存在時，核酸適體與其結合引起構象變化，使得兩段脫氧核酶連在一起。當輔因子存在時，脫氧核酶被活化，可以切割核酸底物并產生可檢測信號[44]。脫氧核酶的主體是特殊序列的核酸，也可以通過部分雜交脫氧核酶序列來抑制其催化活性。當目標分子存在時，脫氧核酶序列完全游離出來，輔因子存在時其催化活性得到恢復。這些設計可用于構建各種脫氧核酶探針。

此外，脫氧核酶具有合成費用低、化學穩定性高、容易進行化學修飾等優點，也可以與熒光染料、納米材料等一起構建各種熒光成像納米探針。納米材料與脫氧核酶探針相結合，同樣可以保護負載的脫氧核酶探針不被核酸酶降解，并且無需轉染試劑就能進入細胞。脫氧核酶對其輔因子具有特異性識別能力，所以脫氧核酶功能化納米探針可用于其對應輔因子的特異性熒光成像分析。由于納米材料對多種熒光染料都具有很強的熒光淬滅能力。所以，納米材料可以同時修飾不同染料標記的不同脫氧核酶探針，從而實現對多種輔因子的同時熒光成像分析。例如，Tang課題組利用納米金輔助構建脫氧核酶功能化納米探針(如圖9(a)所示)，實現細胞內Zn2+和Cu2+的同時成像分析。活細胞內的Zn2+和 Cu2+在調節細胞生物功能方面起著非常重要的作用。這些金屬離子又可以作為脫氧核酶的輔因子并使其具有催化活性。作者把Zn2+特異性的脫氧核酶(Zn-Enz)和Cu2+特異性的脫氧核酶(Cu-Enz)分別與其底物鏈雜交并通過金-巰鍵修飾于納米金表面。兩種底物鏈分別標記熒光基團(FAM或Cy5)和淬滅基團(BHQ-1或BHQ-2)。兩種熒光基團的熒光能夠同時被納米金和對應的淬滅基團淬滅。當核酸納米探針傳輸進入細胞，細胞內的目標Zn2+或Cu2+存在時，對應的脫氧核酶能夠被活化進而切割核酸底物，包含熒光基團的短核酸鏈會游離出來，其熒光得到恢復。FAM染料熒光恢復情況與Zn2+濃度相關，Cy5染料熒光恢復情況與Cu2+濃度相關，從而實現活細胞內Zn2+和 Cu2+同時熒光成像分析[45]。

圖9 (a)活細胞內基于脫氧核酶功能化納米金的Zn2+和 Cu2+同時熒光成像研究[45]；(b)核酸適體功能化的脫氧核酶與納米金結合用于活細胞內目標分子的放大熒光成像[46] Fig.9 (a)Simultaneous fluorescence imaging of Zn2+ and Cu2+ in living cells based on DNAzyme modified gold nanoparticle[45]; (b)aptazyme-gold nanoparticle sensor for amplified molecular probing in living cells[46]

前面已經介紹到通過核酸雜交或者核酸適體與目標分子結合可以誘導有活性的脫氧核酶形成，所以脫氧核酶輔助構建的核酸納米探針也可以用于核酸或其他目標分子的成像分析。由于脫氧核酶切割核酸底物后，核酸底物會斷成兩半、結合力減弱，使得活性脫氧核酶能夠游離出來繼續進行下一輪的切割。通過巧妙設計，脫氧核酶功能化納米探針用于其他目標分子分析時，可以達到成像信號放大的效果。例如，Wang課題組利用核酸適體功能化的脫氧核酶與納米金相結合來實現活細胞內目標分子的熒光成像信號放大(如圖9(b)所示)。作者選用的是三磷酸腺苷(ATP)的核酸適體和Mg2+特異性響應的脫氧核酶。把核酸適體和脫氧核酶設計在一條序列里，只有當核酸適體與目標分子結合形成特殊構象后，脫氧核酶才能夠被活化。這條核酸適體/脫氧核酶序列在5’端標記淬滅基團，與3′端標記熒光基團的底物鏈雜交后修飾于納米金表面。當目標ATP不存在時，脫氧核酶沒有催化活性，熒光基團的熒光同時被納米金和淬滅基團淬滅。當脫氧核酶功能化納米探針被細胞攝取后，核酸適體能夠與細胞內的ATP結合形成特殊構象，從而活化脫氧核酶使其在輔因子存在時具有催化活性。活化的脫氧核酶能夠切割底物鏈，釋放出熒光團標記的核酸片段，使其熒光得到恢復。此時，該脫氧核酶能夠游離出來與納米金表面的另一條底物鏈結合并切割底物鏈。在切割循環過程中，少量的ATP就能誘導切割納米金表面熒光基團標記的許多底物鏈，獲得放大的熒光信號，從而實現對目標ATP的成像信號放大分析[46]。核酸適體能夠特異性響應離子、小分子、蛋白等各種目標分子，所以脫氧核酶功能化納米探針與核酸適體相結合有望用于許多生物標志物的熒光成像分析。

脫氧核酶功能化納米探針也能夠用于核酸分子的熒光成像信號放大分析。例如，Le課題組構建了一種脫氧核酶功能化納米探針，利用活細胞內的miRNA活化脫氧核酶使其循環切割底物鏈，得到放大的熒光信號，從而實現對目標miRNA的熒光成像信號放大分析(如圖10(a)所示)。作者選用納米金作為載體和淬滅劑，其表面修飾底物鏈和被鎖鏈抑制活性的脫氧核酶探針，鎖鏈末端標記Cy5熒光基團，底物鏈末端標記FAM熒光基團。鎖鏈可以設計成能特異性響應細胞內目標分子的探針，這里選擇的是miRNA。當脫氧核酶被抑制活性時，Cy5和FAM的熒光都被納米金淬滅。當脫氧核酶功能化納米探針被細胞攝取后，細胞內的miRNA能夠通過鏈置換作用與鎖鏈雜交，使得脫氧核酶鏈游離出來與納米金表面的底物鏈結合。輔因子存在時，脫氧核酶能夠切割底物鏈并釋放出FAM標記的核酸片段。此時，脫氧核酶能夠游離出來與下一條底物鏈結合并切割底物鏈，該反應能夠沿著納米金自發的持續進行。每進行一次底物鏈切割時，都伴隨著釋放出一個熒光染料標記的核酸片段，由于熒光染料遠離了納米金，其熒光得到恢復。通過檢測熒光信號，可實現對目標miRNA的信號放大熒光成像分析[47]。

圖10 (a)活細胞內miRNA觸發脫氧核酶活化[47]；(b)納米金-發夾型脫氧核酶探針用于活細胞內miRNA成像信號放大[48] Fig.10 (a)MicroRNA-initiated DNAzyme activation in living cells[47]; (b)AuNP-based hairpin-DNAzyme probe for amplification detection of miRNA in living cells[48]

脫氧核酶功能化納米探針用于目標分子熒光成像信號放大分析時，不僅可以通過目標分子活化的脫氧核酶循環切割底物鏈來實現熒光信號放大，也可以通過目標分子循環活化脫氧核酶來獲得信號放大效果。例如，Wang課題組利用發夾型脫氧核酶和納米金構建了一種成像納米探針并用于活細胞內miRNA的熒光成像信號放大研究。當目標分子不存在時，脫氧核酶通過形成發夾結構來抑制其催化活性。探針的一端標記熒光染料，另一端通過金-巰鍵修飾于納米金表面，此時熒光染料的熒光處于淬滅狀態。當脫氧核酶功能化納米探針傳輸進細胞時，細胞內的目標miRNA能夠與脫氧核酶探針雜交并打開其發夾結構。此時，脫氧核酶的酶催化區域完全游離出來，當輔因子Mg2+存在時，脫氧核酶能夠切割同一條鏈上的酶切位點，把脫氧核酶探針分成兩段。切割后，這兩段核酸片段與目標miRNA的雜交變得相對不穩定，從而與目標miRNA分開。熒光染料標記的那條核酸片段就會從納米金表面脫落，其熒光得到恢復。此外，目標miRNA也能夠釋放出來，與另一個發夾型脫氧核酶探針相結合從而引發新一輪的熒光信號產生。這種目標分子循環的信號放大過程能夠顯著增強熒光信號，從而實現對目標miRNA的高靈敏成像分析[48]。

脫氧核酶不僅可以以細胞內現有的金屬離子作為輔因子，也可以通過納米材料傳輸輔因子進入細胞。例如，氧化鋅納米顆粒、二氧化錳納米片等納米材料不僅可以作為脫氧核酶探針的載體，輔助脫氧核酶探針傳輸進入細胞。這些納米材料進入細胞后還可以降解產生Zn2+或Mn2+等輔因子，從而使脫氧核酶發揮作用[49-50]。總的來說，脫氧核酶功能化納米探針不僅能夠用于細胞內對應輔因子的特異性成像分析，還可以通過成像信號放大實現對核酸或其他目標分子的高靈敏熒光成像分析。

6 結束語

本綜述主要討論核酸功能化納米探針在細胞熒光成像方面的應用，主要包括反義寡核苷酸功能化納米探針、核酸適體功能化納米探針以及脫氧核酶功能化納米探針，同時介紹了這些核酸功能化納米探針在成像信號放大分析中的應用。反義寡核苷酸功能化納米探針可用于活細胞內mRNA、miRNA等核酸分子的熒光成像分析。此外，為解決細胞內低含量目標核酸難以監測的問題，核酸納米探針還可以與一些基于脫氧核酶或者核酸之間自組裝的成像信號放大方法相結合來提高成像靈敏度。核酸適體功能化納米探針不僅能夠用于核酸適體特異性識別的目標分子的熒光成像分析，也能夠單純作為癌細胞靶向探針，提高核酸適體功能化納米探針在癌細胞中的富集。脫氧核酶功能化納米探針不僅能夠用于其對應輔因子的特異性熒光成像分析，也可以與反義寡核苷酸或核酸適體相結合，通過成像信號放大實現對核酸或其他目標分子的高靈敏熒光成像分析。

總的來說，核酸功能化納米探針能夠用于各種生物標志物的熒光分析與成像研究。然而，細胞內許多生物標志物的含量很低，并且是動態變化的。此外，各種疾病的發生發展，往往是多種生物標志物同時起作用的結果。目前已發展的核酸功能化納米探針用于細胞內生物標志物的成像分析時，仍存在著選擇性較差、靈敏度較低的問題。而且，能夠同時檢測多種生物標志物的核酸功能化納米探針也仍然有限。在未來，核酸功能化納米探針希望能夠繼續完善和發展，從而實現癌癥相關標志物的高靈敏、高特異性熒光成像分析，并在癌癥早期診斷和預后監測中發揮作用。

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