直鏈烷基苯磺酸鈉對雌性小鼠卵巢類固醇激素合成的影響*

劉小強 ，李 丹 ，王 琦 ，任春娥

（1.山東省青島市婦女兒童醫(yī)院，山東 青島 266034； 2.山東省青島市中心醫(yī)院，山東 青島 266031；3.濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院，山東 濰坊 261031）

生殖健康為目前日益凸顯的醫(yī)療難題，環(huán)境污染可引起生殖細胞損傷而導致胎源性疾病發(fā)生，繼而影響胚胎發(fā)育和新生代健康[1－2]。表面活性劑為人工合成的化學洗滌劑，日常應用頻繁，可通過人體直接接觸、餐具、蔬果殘留等多種途徑進入人體。直鏈烷基苯磺酸鈉（linear alkylbenzene sulfonate，LAS）是常見化學洗滌劑中的表面活性劑成分，在人體內(nèi)含量雖小，但難以消除，長期蓄積會影響動物生殖系統(tǒng)[3－4]。LAS暴露對機體生殖系統(tǒng)的作用受到其暴露的濃度、時間、體內(nèi)代謝方式等多種因素的影響，而在現(xiàn)實生活中受實驗技術及倫理學等限制，LAS暴露對宮內(nèi)胚胎及生育功能影響的研究難以展開，主要通過小鼠等動物進行研究[5]。為明確LAS對雌性子代生殖系統(tǒng)的影響，本研究中通過LAS染毒妊娠小鼠，觀察其子代類固醇激素合成情況及可能機制，為預防和干預LAS對生殖系統(tǒng)的影響提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器與試藥

1.1.1 動物

40只妊娠小鼠均來源于南京大學模式動物研究中心，實驗動物許可證號為scxk（蘇）2010－0001，購買后均單籠飼養(yǎng)，自由攝食和飲水，晝夜節(jié)律正常。本研究符合倫理學標準，并經(jīng)我院倫理學委員會審核批準。

1.1.2 儀器與試藥

詳見表1。

表1 儀器與試藥名稱及其來源

1.2 方法

1.2.1 分組

將40只小鼠進行編號，并按隨機數(shù)字表法分為研究組和對照組，各20只。分組信息貼于籠子顯眼位置，避免后續(xù)處理錯漏。兩組小鼠的性別、妊娠時間、入組時體質(zhì)量等一般資料比較均無明顯差異（P＞0.05），具有可比性。詳見表2。

表2 兩組小鼠一般資料比較（n＝20）

1.2.2 給藥

研究組于妊娠第5～20天以生理鹽水為溶劑，每天以 150 mg/kg LAS（CAS號為 25155－30－0）灌胃染毒，灌胃溶液體積為每10 g體質(zhì)量 1 mL，期間每5天稱1次體質(zhì)量，并相應調(diào)整灌胃溶液體積。對照組小鼠同期每天以等量生理鹽水灌胃。

1.2.3 子代分娩及處理

兩組小鼠均飼養(yǎng)至分娩，期間無死亡，均正常分娩。選出兩組子代雌性小鼠，飼養(yǎng)條件同母代小鼠，飼養(yǎng)、觀察子代雌性小鼠發(fā)育情況至10周齡，子代雌性小鼠發(fā)情間期頸椎脫位處死，取血和卵巢于液氮中速凍冷藏。

1.2.4 血清指標檢測

取獲得的血液標本以3 500 r/min的轉(zhuǎn)速和3 cm半徑離心處理10 min，分離出上層血清，用于相關指標檢測，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測并比較兩組子代雌性小鼠血清卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）及睪酮（T）等類固醇激素水平和血清超氧化物歧化酶（SOD）活力、丙二醛（MDA）等氧化應激指標水平，操作均由同一相關檢測經(jīng)驗3年以上檢驗科人員進行，具體操作嚴格儀器及試劑盒說明書進行。

1.2.5 聚合酶鏈反應（PCR）檢測和電泳分析

取子代雌性小鼠卵巢，Trizol法常規(guī)提取總RNA后逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，以β－actin作為內(nèi)參照，對卵巢中類固醇激素急性調(diào)節(jié)蛋白（StAR）、細胞色素P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶（P450scc）mRNA相對表達量進行檢測，其中StAR上游引物為5′－CTGCTAGACCAGCCCATGGAC －3′，下 游 引 物 為 5′－TGATTTCCTTGACATTTGGGTTCC －3′，片段大小 546 bp；P450scc上游引物為5′－ TCCAGAGGACCCAGGTTCAA －3′，下游引物為 5′－CATCAGGTGTCAAATCTTGGACTT －3′，片段大小 496bp；β－actin 上游引物為 5′－TAAAGACCTCTATGCCAACACAG － 3′，下游引物為 5′－ CACGGATGGAGGGGCCGACTCATC － 3′，片段大小 241 bp。反應體系 20 μL，含2 μL 的 10 × Taq Buffer，1.5 μL 的 25 mmol/L MgCl2，1 μL 的 10 mmol/L dNTP，1 μL 的 10 pmol/μL 相應上游引物，1 μL 的 10 pmol/μL 相應下游引物，1.5 μL 的cDNA 模板，10.5 μL 的 DEPC 水，0.5 μL 的 1 U/μL Taq酶。具體 PCR 反應條件：StAR：94℃4 min、94℃0.5 min、50 ℃ 0.5 min、72 ℃0.5 min、72 ℃5 min，共35 個循環(huán)；P450scc，94 ℃4 min、94 ℃0.5 min、50 ℃0.5 min、72 ℃0.5 min、72 ℃5 min，共 30 個循環(huán)；β－actin反應條件與目的條件一致。取5 μL PCR產(chǎn)物常規(guī)行凝膠電泳，紫外燈下拍照后采用Image pro Plus圖像分析系統(tǒng)計算光密度值，將目的基因與β－actin基因光密度值比值為目的基因相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件分析。計量資料均符合正態(tài)分布，組間比較采用獨立樣本 t檢驗，采用Pearson線性相關分析法分析研究組子代雌性小鼠血清氧化應激指標水平與其血清類固醇激素水平，以及卵巢StAR和P450scc mRNA相對表達量的關系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組子代性別

兩組小鼠均為單胎妊娠。研究組子代雌性小鼠13只，雄性7只；對照組子代雌性小鼠15只，雄性5只。

2.2 兩組雌性子代血清類固醇激素、氧化應激指標水平及卵巢不同mRNA相對表達量

與對照組子代雌性小鼠比較，研究組子代雌性小鼠的血清FSH，LH，E2，T等類固醇激素水平，血清SOD活力，以及卵巢StAR和P450scc mRNA相對表達量均降低，血清MDA水平則升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表3、圖1和圖2。

表3 兩組子代雌性小鼠血清類固醇激素、氧化應激指標水平及卵巢StAR和P450scc mRNA相對表達量比較（n＝20）

圖1 兩組子代雌性小鼠卵巢StAR及mRNA相對表達量

2.3 研究組雌性子代血清氧化應激指標與類固醇激素及卵巢不同m RNA相對表達量的相關性

Pearson線性相關分析結(jié)果顯示，研究組子代雌性小鼠血清 SOD活力與其血清FSH，LH，E2，T等類固醇激素水平及卵巢StAR和P450scc mRNA相對表達量均呈正相關（r＝0.866，0.805，0.798，0.836，0.818，0.897，P＜0.05），其血清MDA水平與前述類固醇激素水平及卵巢StAR和P450scc mRNA相對表達量則呈負相關（r＝－0.811， －0.835， －0.872， －0.818， －0.806， －0.857，P ＜ 0.05）。

3 討論

圖2 兩組子代雌性小鼠卵巢P450scc mRNA相對表達量

本研究中采用LAS灌胃妊娠小鼠，并以生理鹽水灌胃為對照，觀察了胚胎期LAS暴露對子代小鼠卵巢類固醇激素合成的影響。結(jié)果顯示，相對于生理鹽水對照組，LAS灌胃妊娠小鼠的子代雌性小鼠的血清FSH，LH，E2，T等類固醇激素水平及卵巢 StAR和 P450scc mRNA相對表達量均降低，其機制可能為LAS導致的生殖細胞結(jié)構破壞和凋亡導致類固醇激素合成能力降低，可引發(fā)生殖系統(tǒng)功能紊亂，降低生殖系統(tǒng)功能。LAS為表面活性劑的主要成分，而表面活性劑在日常洗滌中應用普遍，因此人體普遍暴露在LAS中，雖量較小，但長期蓄積可能對人體造成一定影響[6－7]。人體中生殖器官極易受到環(huán)境因素的影響，而胚胎期及青春期生殖系統(tǒng)發(fā)育高峰若受到化學污染物的影響可影響生殖細胞功能，導致體內(nèi)內(nèi)分泌異常，影響生殖系統(tǒng)激素合成分泌，影響生殖功能[8－10]。竇曉衛(wèi)等[11]和韓海艷等[12]的研究均證實了LAS在生殖能力上的負面作用，這與本研究結(jié)果一致。故對LAS相關生殖系統(tǒng)不良影響進行防治十分重要，明確LAS在生殖系統(tǒng)中的具體影響及其機制可為其相關不良影響的防治提供依據(jù)。

LAS進入人體后需氧化降解，因此可引發(fā)體內(nèi)自由基水平的明顯升高，從而導致脂質(zhì)過氧化增強和抗氧化酶活力降低[13]。已有研究證實，LAS可引發(fā)抗氧化能力的降低而導致肝臟功能損傷[14－15]。因此，氧化應激的增強亦可能為LAS影響卵巢類固醇激素合成的重要途徑。本研究中亦關注了LAS對子代雌性小鼠氧化應激狀況的影響，結(jié)果顯示，相對于生理鹽水對照組，LAS灌胃妊娠小鼠的子代雌性小鼠的血清SOD活力降低而血清MDA水平則升高，其氧化應激反應嚴重，而抗氧化應激能力降低，進一步證實了“LAS通過促進氧化應激導致妊娠小鼠的子代雌性小鼠卵巢類固醇激素合成功能降低”的假設，亦與趙文紅等[14－15]的研究中LAS通過氧化應激途徑影響細胞功能，造成器官損傷的結(jié)論一致，提示抗氧化可能為減輕LAS對機體造成不良影響的途徑。

本研究結(jié)果顯示，隨著LAS灌胃妊娠小鼠的子代雌性小鼠血清 SOD活力的降低，其血清 FSH，LH，E2，T等類固醇激素水平同步降低，而隨著血清MDA水平的升高，其血清FSH，LH，E2，T等類固醇激素水平規(guī)律下降[16]，提示其氧化應激指標可能與血清類固醇激素水平及卵巢StAR和P450scc mRNA相對表達量相關。進一步的Pearson線性相關分析結(jié)果顯示，研究組子代雌性小鼠血清SOD活力與其血清類固醇激素水平及卵巢StAR和P450scc mRNA相對表達量均呈正相關，其血清MDA水平與其血清類固醇激素水平及卵巢StAR和P450scc mRNA相對表達量則呈負相關，受LAS影響妊娠小鼠的子代雌性小鼠氧化應激狀態(tài)異常，且與其類固醇激素水平和卵巢類固醇激素合成能力相關，進一步證實了胚胎期LAS通過促進氧化應激導致妊娠小鼠的子代雌性小鼠卵巢類固醇激素合成功能降低。

綜上所述，LAS可影響雌性小鼠卵巢類固醇激素合成，而氧化應激可能為LAS影響卵巢類固醇激素合成的機制和干預依據(jù)。在LAS暴露廣泛的情況下，適當抗氧化干預可能減少其對子代卵巢類固醇激素合成的影響，改善子代生殖系統(tǒng)功能，尚需進一步研究證實。

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