高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定華法林鈉片的含量

華法林鈉是一種雙香豆素類抗凝藥物[1]，其能抑制肝臟內(nèi)凝血酶原和凝血因子合成。該藥物口服于胃腸道吸收迅速而完全，臨床上常制成片劑用于輔助治療肺栓塞、術(shù)后栓塞、心肌梗死等血栓栓塞性疾病[2]。華法林鈉用量少，規(guī)格通常為每片2.5 mg，過(guò)量使用易致各種出血，針對(duì)肝腎功能不全、活動(dòng)性潰瘍、嚴(yán)重高血壓、腦出血患者需慎用[3]。因此，需要靈敏、準(zhǔn)確的測(cè)定方法作為華法林鈉片質(zhì)量控制的有效方法[4]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)測(cè)定華法林鈉含量的方法進(jìn)行了較多研究[5]，但對(duì)采用高效液相色譜（HPLC）-熒光檢測(cè)法測(cè)定華法林鈉片的含量卻鮮有報(bào)道。HPLC-熒光檢測(cè)法靈敏，簡(jiǎn)便，快捷。本研究就 HPLC-熒光檢測(cè)法測(cè)定華法林鈉片的含量，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器高效液相色譜儀（日本島津公司）；HW-2000色譜工作站；AY120D電子天平（日本島津公司）；UV1101紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海天美科學(xué)儀器有限公司）；DL-360超聲波清洗儀；HP-01溶劑過(guò)濾器；ELGA超純水儀。

1.2 試劑與試藥華法林鈉片（上海信宜九福藥業(yè)有限公司，規(guī)格：2.5 mg/片，批號(hào)：080701、070603、080901）；華法林鈉化學(xué)原料藥（由上海信宜九福藥業(yè)有限公司提供，純度99.2%）；所用試劑甲醇為色譜純，其余均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

2.1.1 對(duì)照溶液配制精密稱取華法林鈉化學(xué)原料藥50.7 mg，置于50 ml容量瓶中，加適量甲醇至刻度，搖勻，配制成1.006 mg/ml的華法林鈉對(duì)照貯備溶液[6]。精密量取5 ml，置于25 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密量取2 ml，置于25 ml容量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，配制成16.1 μg/ml的華法林鈉對(duì)照溶液。

2.1.2 供試品溶液配制取樣品華法林鈉20片，精密稱定，研細(xì)，混勻。精密稱取適量（約相當(dāng)于華法林鈉5.0 mg），置于25 ml容量瓶中，加甲醇約15 ml，超聲 10 min，攪拌使其充分溶解，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，用移液瓶量取續(xù)濾液2 ml，置于25 ml容量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，用濾膜過(guò)濾，配制成供試品溶液。

2.1.3 陰性空白對(duì)照溶液按中國(guó)藥典處方自制空白片，精密稱取適量，按2.1.2項(xiàng)下供試品溶液配制方法配制成陰性空白對(duì)照溶液[7]。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱：Spherisorb C18（4.6 mm×200 mm，10 μm）；流動(dòng)相：甲醇：0.1%磷酸（75：25）；流速：1.0 ml/min；柱溫：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)380 nm。不同波長(zhǎng)條件的測(cè)定結(jié)果以及 HPLC-熒光檢測(cè)法和紫外-分光光度法（中國(guó)藥典 2015版）測(cè)定[8-9]樣品結(jié)果見(jiàn)表1-2。分別取華法林鈉對(duì)照溶液、供試品溶液和陰性空白對(duì)照溶液20 μl，按上述色譜條件，注入液相色譜儀，記錄色譜圖（見(jiàn)圖1-3）。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以華法林鈉計(jì)算不低于 2800，保留時(shí)間約為4.8 min。華法林鈉陰性空白對(duì)照溶液圖譜顯示在主峰保留時(shí)間前后基線平穩(wěn)，可見(jiàn)輔料對(duì)主藥測(cè)定無(wú)干擾[10]。

表1 不同波長(zhǎng)條件的測(cè)定

圖1 對(duì)照溶液HPLC圖

圖2 供試品溶液HPLC圖譜

圖3 陰性空白對(duì)照溶液HPLC圖譜

表2 兩種方法測(cè)定樣品結(jié)果比較(n＝3)

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制精密量取1.006 mg/ml的華法林鈉對(duì)照貯備溶液5 ml，置于25 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，充分搖勻，得201 μg/ml溶液，分別用量瓶量取上述溶液 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，置于25 ml容量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，即得濃度分別為4.03、8.06、16.1、24.2、32.2、40.3 μg/ml的華法林鈉對(duì)照溶液。按色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，華法林鈉對(duì)照溶液濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為：Y=130 952X+65 016，相關(guān)系數(shù)r=0.9999（n=6），結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，華法林鈉在4.03～40.3 μg/ml濃度范圍內(nèi)，峰面積與其濃度呈良好線性關(guān)系[11-12]。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定的結(jié)果

圖4 華法林鈉峰面積與華法林鈉濃度線性關(guān)系圖

2.3.2 精密度試驗(yàn)按色譜條件下，取濃度為16.1 μg/ml的華法林鈉對(duì)照溶液，進(jìn)樣20 μl，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，華法林鈉對(duì)照溶液峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.60%（n=6），表明此儀器精密度良好。結(jié)果見(jiàn)表4。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)取新配制的供試品溶液，分別于 0、2、4、6、8 、12、24 h 進(jìn)樣 20 μl，記錄色譜圖，測(cè)定華法林鈉峰面積，峰面積RSD為1.9%，可見(jiàn)華法林鈉供試品溶液在2 h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果見(jiàn)表5。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取同一批號(hào)樣品 6份，按“3.1.2”項(xiàng)下制備方法制備供試品溶液，進(jìn)樣20 μl，測(cè)得相對(duì)標(biāo)示含量的RSD為0.71%（n=6）。表明此方法的重復(fù)性良好，結(jié)果見(jiàn)表6。

表4 精密度試驗(yàn)結(jié)果

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

表6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.5 回收率試驗(yàn)取華法林鈉對(duì)照品適量，精密稱定。分別按處方加入輔料，按“3.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。分別進(jìn)樣20 μl，測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果平均回收率為101.1%，RSD=0.60%（n=6），表明此方法準(zhǔn)確可靠，見(jiàn)表7。

表7 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3.6 樣品測(cè)定分別取 3個(gè)批號(hào)的華法林鈉片，精密稱取適量，按照“3.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得相對(duì)標(biāo)示百分含量分別為101.3%、101.5%和101.7%，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 樣品測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 HPLC流動(dòng)相選擇參考相關(guān)研究報(bào)道的華法林及其衍生物采用的流動(dòng)相，并根據(jù)實(shí)際情況，進(jìn)行流動(dòng)相選擇試驗(yàn)，采用不同比例甲醇：1%冰醋酸、甲醇：0.2%冰醋酸、甲醇：水、0.1%磷酸：0.15%三已胺：已腈、甲醇：0.1%磷酸進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明流動(dòng)相為甲醇：0.1%磷酸（75：25）時(shí)，華法林鈉色譜峰形好，分離度符合要求，靈敏度高，保留時(shí)間適中[13]。因此選用甲醇：0.1%磷酸（75：25）為流動(dòng)相，流速為1.0 ml/min。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇研究報(bào)道[14]華法林及其衍生物發(fā)射波長(zhǎng)在380 nm處有最大吸收，而最大激發(fā)波長(zhǎng)為270～310 nm。取對(duì)照溶液20 ul，分別在激發(fā)波長(zhǎng)為270、280、290、300、310 nm及發(fā)射波長(zhǎng)為380 nm時(shí)進(jìn)樣，結(jié)果以280 nm作為激發(fā)波長(zhǎng)、380 nm作為發(fā)射波長(zhǎng)，峰面積最大，靈敏度較高。因此，選用280 nm作為激發(fā)波長(zhǎng)、380 nm作為發(fā)射波長(zhǎng)。

3.3 實(shí)驗(yàn)過(guò)程需要注意的問(wèn)題在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的玻璃儀器需采用洗滌劑沖洗干凈，防止污染熒光物質(zhì)，不能用洗衣粉清洗儀器，因?yàn)槠浜袩晒庠霭讋?，?huì)對(duì)測(cè)定樣品造成嚴(yán)重干擾[15]；而測(cè)定樣品中的輔料不會(huì)對(duì)熒光測(cè)定有影響，華法林鈉的熒光對(duì)溫度很敏感，溫度越低，熒光越靈敏，測(cè)出的峰面積越大，在測(cè)試過(guò)程應(yīng)保持溫度恒定，恒定溫度可確保實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定[16]。

3.4 紫外-分光光度計(jì)算法與 HPLC-熒光檢測(cè)法比較中華人民共和國(guó)藥典（2015年版）采用紫外-分光光度法測(cè)定華法林鈉片含量，樣品需采用三氯甲烷和0.01 mol/L的NaOH分別提取3次，耗時(shí)較長(zhǎng)[17]。而采用 HPLC-熒光檢測(cè)法測(cè)定華法林鈉片含量，樣品直接加甲醇超聲10 min即可，方法簡(jiǎn)便、快捷、靈敏，且與外-分光光度法測(cè)定的結(jié)果相一致。

4 結(jié)論

藥物分析的方法應(yīng)該不斷探索，尋找更簡(jiǎn)單、更準(zhǔn)確的方法，需要敢于創(chuàng)新，能更有效用于藥物質(zhì)量控制。本研究結(jié)果表明，采用 HPLC-熒光檢測(cè)法測(cè)定華法林鈉片含量方法簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，其測(cè)定的華法林鈉片含量為4.03～40.3μg/ml，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可作為華法林鈉片質(zhì)量控制的有效方法[5,17]。

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