T-cadherin在胃癌組織中的表達及臨床意義*

韋 斌，史海濤

1.西安市第一醫院消化內科(西安710002)，2.西安交通大學第二附屬醫院消化內科(西安710004)

據最新流行病學統計，胃癌仍然是世界上第四種最常見的癌癥和第二常見的癌癥死亡原因[1]。由于缺乏特異的臨床表現，大多數胃癌在診斷時已處于疾病晚期，各種治療方法效果均欠佳，總體5年生存率僅為5% ～ 15%。對于晚期患者、手術失敗以及術后復發的患者，目前尚無有效的治療方法。化療和放療不僅殺死癌細胞，而且殺死正常組織細胞，因此會造成嚴重的副作用[2]。分子靶向治療一直是腫瘤研究領域的熱點，尋找一個新的有效的分子靶標可以為胃癌的治療提供新的方向。

研究表明，細胞間粘附決定細胞極性、參與細胞分化和維持組織內穩態。在腫瘤發生進展過程中，細胞粘附被打亂，從而造成信號的損失、接觸抑制及改變細胞的遷移[3]。越來越多的證據表明，細胞間粘附分子作為癌基因或抑癌基因在腫瘤發病中發揮重要作用[4-5]。T-鈣粘蛋白(T-cadherin)，也稱鈣粘蛋白13(CDH13)，是鈣粘蛋白家族非典型成員，其通過糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定到細胞膜上。一些研究已經表明，T-cadherin為腫瘤抑制基因，在多種癌癥中沉默表達，如肝癌[6]、結腸癌[7]、膽囊癌[8]、黑色素瘤[9]、肺[10]和乳腺癌[11]。新近研究表明，T-cadherin重新表達可抑制腫瘤細胞增殖、血管生成和侵襲，增加細胞凋亡的敏感性，抑制腫瘤的生長[3]。然而，關于T-cadherin在胃癌中的表達及與胃癌進展的關系研究較少。本研究旨在觀察T-cadherin在胃癌中的表達，及與臨床病例特征和預后的關系。

材料與方法

1 病例和標本 選擇2010年1月至2012年6月于西安交通大學第二附屬醫院確診為胃癌并接受手術的患者166例，分別留取胃癌和癌旁正常組織標本，癌旁組織取自腫瘤邊緣5 cm外正常組織，并經病理檢查未發現癌細胞。166例患者中，男108，女58例，平均年齡(62.3±10.3)歲。所有患者采用C14呼氣試驗檢測幽門螺桿菌(Helicobacter pylori， HP)感染情況。每例標本分成3份，一份放入4%甲醛溶液固定，經石蠟包埋后用于免疫組化檢測，另2份用PBS沖洗后予以液氮冷凍，保存至80°C提取RNA和蛋白備用。同時收集患者性別、年齡、吸煙、飲酒史、幽門螺桿菌感染、腫瘤大小、淋巴結轉移以、TNM分期及生存情況。本研究獲得西安交通大學第二附屬醫院倫理委員會審批通過。

2 Real time-PCR檢測T-cadherin mRNA表達 采用Trizol試劑提取總RNA(GIBCO公司，美國)，cDNA合成按照Fermentas逆轉錄試劑盒操作說明提取。引物設計及合成以NCBI Genebank中提供的人類基因序列行T-cadherin、β-Actin的引物設計，由Takara生物工程(大連)有限公司合成。T-cadherin上游引物： 5’-gatgttggcaaggtagtcgat-3’，下游引物：5’-gctccctgtgttctcattgat-3’；β-actin上游引物：5’ - atcgtgcgtgacattaaggagaag-3’'，下游引物：5’-aggaaggaaggctggaagagtg -3’。反應體系包括模板cDNA 1 μl， 上游引物(10 μmol/L)1 μl，下游引物(10 μmol/L)1 μl，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μl，ddH2O 7 μl，置于熒光定量PCR儀中進行擴增，反應條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s；60 ℃ 30 s；共40個循環。PCR反應結束后，將PCR反應液溫度自60 ℃至95 ℃緩慢升溫，實時監測SYBR GreenⅠ的熒光信號強度變化，獲取融解曲線，以確認PCR反應的特異性。目的基因相對表達水平參考文獻[11]為2-ΔΔCT = 2-(ΔCta -ΔCtb)，ΔCt = Ct(目的基因)-Ct(內參基因)，a、b分別代表兩組樣本，其中a代表實驗組，b代表對照組，Ct為根據擴增曲線確定的擴增循環數。

3 Western blot檢測T-cadherin 蛋白表達 按照總蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，加上樣緩沖液，在聚丙稀酰胺凝膠中電泳，將蛋白電轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉后分別與抗β-actin、抗T-cadherin多克隆抗體孵育，再與相應的二抗反應，陽性條帶用化學發光法檢測。結果用Gel-pro分析軟件進行分析，計算目的蛋白與相應內參的光密度比值。

4 免疫組織化檢測T-cadherin 蛋白表達 石蠟包埋組織切片經抗原修復和血清封閉后，滴加適量T-cadherin一抗(大鼠抗人多克隆抗體，Santa cruz，美國，1∶100)，4℃過夜。第2天采用PBS清洗后滴加生物素標記的二抗及鏈霉菌生物素-過氧化物酶，DAB顯色，蘇木精復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。兩位病理學家對免疫組化切片進行了評估。以PBS代替一抗作為陰性對照，正置顯微鏡Olympus 400×拍照，每張切片隨機選取5個視野，計數100～200個細胞，T-cadherin的表達水平即IHC評分為染色強度與染色面積的乘積，染色強度為0：無染色；1：弱陽性；2：中度染色；3：強陽性，染色面積為0：<5%，1：5% ～25%，2:25～50%，3：> 50%。基于T-鈣粘蛋白的表達水平，胃癌患者分為兩組：低表達組(IHC≤評分3)和高表達組(IHC評分>3)。

5 統計學方法 采用SPSS 13.0統計學軟件進行。配對樣本t檢驗分析T-cadherin mRNA和蛋白水平在胃癌及癌旁組織中的表達。卡方檢驗分析T-cadherin表達與各種臨床病理特征相關性。采用Kaplan Meier法計算總生存曲線，并用log-rank檢驗進行分析。采用Cox比例風險回歸模型來確定影響胃癌患者的變量。P<0.05代表差異有統計學意義。

結 果

1 Real-time PCR 和 Western blot分析胃癌及癌旁組織中T-cadherin的表達 采用Real-time PCR檢測腫瘤組織及癌旁正常組織中T-cadherin的mRNA的表達，采用Western blot和免疫組化檢測T-cadherin蛋白的表達。結果表明無論是mRNA水平還是蛋白水平，與癌旁正常組織相比，T-cadherin的表達在胃癌組織中均明顯降低(圖1～3)。

2 胃癌組織中T-cadherin的表達與臨床病理特征的相關性 由圖3可以看出，T-cadherin主要在胃癌細胞膜上表達。在166例胃癌標本中，87例為高表達，81例為低表達，見表1。相鄰的癌旁組織胃粘膜上皮具有較強的陽性染色(圖3)。T-cadherin蛋白表達降低與吸煙、腫瘤體積較大(直徑大于4 cm)、淋巴結轉移、分化差、臨床分期高(P<0.05或P<0.01)相關，而與性別、年齡、飲酒和HP感染無統計學差異(P>0.05)，見表1。

3 T-cadherin和患者的總生存期表達的相關性 T-cadherin高表達的胃癌患者比低表達者具有更好的存活率(P<0.01，圖4)。單因素和多因素Cox回歸分析表明，無吸煙、腫瘤較小(直徑小于4 cm)、無淋巴結轉移、分化、較低TNM分期和T-cadherin高表達與增加的總生存率有關，且T-cadherin是胃癌發病的獨立危險因素(P<0.05)，見表2。而性別、年齡、飲酒、HP感染、組織分型與生存率無相關性(P>0.05)。

圖1 Real-time PCR分析T-cadherin mRNA在胃癌及癌旁組織中的表達

圖2 Western blot分析T-cadherin蛋白在胃癌及癌旁組織中的表達

表1 T-cadherin 表達與胃癌臨床病理特征的關系(例)

A: 胃癌組織; B 癌旁組織

圖3 T-cadherin蛋白在胃癌及癌旁組織中的表達

圖4 Kaplan-Meier 生存曲線分析胃癌患者T-cadherin 表達與生存率的關系

表2 Cox回歸分析T-cadherin、臨床病理特征與患者生存的關系

討 論

既往的研究表明，癌癥的進展是一個多步驟的過程，其中細胞-細胞粘附在腫瘤復發、侵襲和遠處轉移的發展中起關鍵作用[12]。許多證據表明，細胞間粘附的缺失使惡性細胞從其起源部位逃逸，降解細胞外基質從而獲得更多的侵襲和轉移表型[13]。早期的證據表明，有一些粘附分子與癌癥相關，如E-cadherin為抑癌基因，而P-cadherin和N-cadherin為癌基因。鈣粘蛋白13(CDH13)，也被稱為T或H-鈣粘蛋白是唯一已知的通過糖基磷脂酰肌醇(GPI)而不是跨膜結構域錨定于細胞膜的鈣黏蛋白。人CDH13基因在許多癌癥中是沉默的，它被認為可抑制癌癥進展[3]。研究表明，T-cadherin可通過多種途徑包括Akt和SET7 / 9-p53通路抑制腫瘤細胞增殖、侵襲以及血管生成[8]。然而，關于T-cadherin在胃癌中的作用研究較少。

大量研究表明T-cadherin的缺失與甲基化有關，去甲基化藥物可重新激活其表達[6-7]。我們的研究表明，T-cadherin蛋白在正常胃上皮細胞和胃癌細胞膜上表達。與相應的正常組織相比，T-cadherin的mRNA和蛋白在胃癌組織中表達明顯減少。其表達與胃癌的臨床病理特征密切相關。T-cadherin蛋白表達降低與腫瘤大小、淋巴結轉移、低分化和高TNM分期相關，與性別、年齡、飲酒和組織病理學類型無關。我們的研究結果表明T-cadherin可能與腫瘤生長與侵襲轉移有關，這一結果與前人的研究結果是一致的。Yan 等發現，增加T-cadherin的表達可降低HepG2細胞增殖。Philippova 等的研究表明，抑制T-cadherin可以增加鱗狀細胞癌侵襲性。Herbert LW等發現，抑制T-cadherin可促進乳腺癌血管生成和轉移。Liu 的研究表明T-cadherin可作為膀胱移行細胞癌獨立的預后標志物。Kim DS表明T-cadherin可作為非小細胞肺癌患者的預后標志物對[10]。既往研究表明， TNM分期、腫瘤分化程度、淋巴轉移等可作為影響胃癌根治術后預后的重要因素，本研究的生存資料表明高T-cadherin表達的患者有顯著較高的術后生存率，高于低表達T-cadherin的患者。T-cadherin低表達的胃癌患者可能提示預后不良，并將需要更積極的補充術后全身治療。因此，T-cadherin蛋白表達的檢測可以幫助我們監控病人的病情。根據Cox回歸分析，腫瘤體積小，無淋巴結轉移、分化程度好、TNM分期早和高表達T-cadherin患者的總體生存率增加，T-cadherin可能是胃癌最重要的獨立預后預測因子。

既往的研究表明，吸煙、飲酒和HP感染是胃癌的危險因素。因此，我們研究了T-cadherin表達與吸煙、飲酒與HP感染的關系。我們的結果表明，有吸煙史的患者T-cadherin表達更低。而飲酒與HP感染與T-cadherin表達無明顯關系。同時，生存資料也表明吸煙患者有較低的術后生存率，飲酒和HP感染與生存率無明顯關系。T-cadherin的表達可能作為一個獨立的預后指標，可作為生物標志物來預測胃癌進展及預后的。我們的研究結果表明，T-cadherin在胃癌中可能作為一個抑癌蛋白發揮作用，其可作為胃癌的治療干預的潛在目標，但其對胃癌細胞增殖、凋亡、侵襲、轉移能力的影響及具體分子機制，尚需進一步深入的研究。

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