26份海州常山種質資源遺傳多樣性的AFLP分析

謝福春， 曾現艷， 程 瑤， 張艷君， 秦 棟， 王華田

(1.東北農業大學園藝園林學院，黑龍江哈爾濱 150030； 2.煙臺新海建筑設計有限責任公司，山東煙臺 264000;3.哈爾濱理工大學榮成學院，山東榮成 264300； 4.山東農業大學林學院，山東泰安 271018)

海州常山(ClerodendrumtrichotomumThunb.)是馬鞭草科(Verbenaceae)大青屬(Clerodendrum)落葉小喬木或灌木，在我國華北、華東、中南和西南各省(區、市)均有分布，常見于山丘陵、荒坡溝谷等地[1]。海州常山具有花形別致，花、果觀賞價值高且觀賞期長的特點，被廣泛應用于城市園林綠化中，同時由于該樹種具有較強的抗鹽、抗旱、耐澇等特性，是干旱瘠薄荒山及礦區廢棄地植被恢復與重建、城市廢棄地綠化、鹽堿地綠化的優良樹種。目前對于海州常山的研究多集中在繁育技術、抗逆性機制、花粉活力的測定及植物化學成分分析等方面[2-6]，而對其遺傳多樣性的研究相對較少。

擴增片段長度多態性(amplified fragment length polymorphism，簡稱AFLP)分子標記技術是一項以PCR反應為基礎的分子標記技術，具有DNA用量少、多態性水平高、檢測位點多、分子識別率高等特點[7-9]，近年來被廣泛應用于雞冠花、銀杏、珙桐和海棠等觀賞植物的遺傳多樣性研究[10-13]。本研究采用DNA-AFLP分子標記技術，對來自我國15個省(區、市)26份種源的海州常山進行遺傳多樣性研究，從分子水平揭示我國海州常山種質資源的遺傳多樣性水平和遺傳進化關系，為海州常山的良種選育和遺傳變異性研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

根據中國數字植物標本館、《中國植物志》及其他相關文獻記載確定海州常山標本采集地點，結合標本采樣地點的地理位置和主要氣象因子(年均溫、日照時數、無霜期、降水量)，對海州常山種源分布進行區域劃分，根據種源區劃確定15個省(區、市)，根據每個省(區、市)資源的分布情況，確定采集地點，共選取26個采集地點(表1)，所選采集地點基本覆蓋了海州常山在國內的分布區域。采集的不同地區的海州常山種源種植于山東農業大學種質資源圃，本試驗采集的幼嫩葉片均是來自不同地區的海州常山3年生萌蘗苗。

1.2 DNA提取

每個種源從5個單株中各取2張幼嫩葉片混合取樣 50 mg，利用改良的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法[14]提取海州常山葉片基因組總DNA，采用紫外分光光度計和0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的質量和濃度，將樣品稀釋到50 μg/mL，于-20 ℃保存備用。

1.3 AFLP分析

參照Vos等的方法[15]，用EcoRⅠ+MseⅠ內切酶組合對基因組DNA進行酶切，從64對AFLP引物中篩選出條帶清晰、多態性高的8對引物組合(表2)。預擴增總反應體系：酶切連接產物2 μL，Pre-AMPmix 1 μL，dNTPs 1 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，2.5 U/μLTaq0.5 μL，ddH2O 18 μL，共 25 μL。預擴增PCR程序：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性 30 s，56 ℃復性30 s，72 ℃延伸1 min，循環30次；72 ℃延伸 5 min。將PCR產物稀釋20倍后作為選擇性擴增模板，選擇性擴增體系同上。PCR擴增程序：94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，1個循環，然后以每次循環復性溫度逐級降低0.7 ℃的梯度繼續進行12個循環，變性和延伸條件同上，最后以94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，23個循環結束。PCR產物經 95 ℃變性 10 min 后用4%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染法檢測。

表1 海州常山采樣地概況

表2 海州常山熒光AFLP引物篩選中供試的64對引物組合

1.4 數據分析

用377DNA自動檢測儀掃描電泳膠圖，用Gene Scan3.1軟件對電泳膠圖進行數據提取，通過Binthere軟件分析各片段大小。利用Excel 2007將原始數據中有帶的換成“1”，無帶的換成“0”，構建“01”矩陣。利用POPGENE version1.31軟件計算遺傳多樣性參數：多態帶數(AP)和多態帶百分率(P)；觀測等位基因數(Na)、觀測的有效等位基因數(Ne)、香農信息指數(I)、Nei’s基因多樣性(H)。用NTSYSpc-2.11F軟件進行數據分析。對原始矩陣用Sim Qual程序求DICE相似系數矩陣，并獲得相似系數矩陣。用SHAN程序中的非加權組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，簡稱UPGMA)方法進行聚類分析，并通過Treeplot模塊生成聚類圖(圖1)。

2 結果與分析

2.1 AFLP擴增結果

從64對引物組合中篩選出8對譜帶清晰、多態性高且穩定的引物組合，這8對引物擴增圖譜顯示電泳帶數目豐富，分帶清晰(圖2)。擴增片段的大小在70～500 bp之間，且分布相對均勻。8對引物組合共擴增出1 042條條帶，其中多態性條帶1 030條，占比為的98.85%。不同引物組合擴增出的多態性條帶總數范圍在115～148條之間，平均為128.75條；不同引物組合平均多態性條帶比例為98.87%(表3)。不同引物產生的條帶數存在一定的差異，其中E-ACA/M-CAG引物產生的條帶最多，為151條，而E-AGC/M-CAG引物產生的條帶最少，為116條。引物組合E-AGC/M-CAG和E-AGG/M-CAA擴增出的位點全部具有多態性，而引物組合 E-ACA/M-CAG的多態性位點的比例最低，為98.01%。以上分析表明，所選擇的引物在海州常山種源間表現了較高的多態性。

表3 AFLP選擇性擴增引物產生的條帶多態性

采用POPGENE軟件對不同引物組合對海州常山的遺傳多樣性進行分析。由表4可知：26份海州常山種質資源平均觀測等位基因數為1.562 5個，平均有效等位基因數為 1.226 0個，平均Nei’s基因多樣性、平均香農信息指數分別為0.142 0、0.225 5，以上數據顯示，我國海州常山的多態性豐富，種源間的遺傳多樣性較高，存在豐富的變異。

2.2 不同海州常山種質資源的遺傳相似性系數分析

采用NTSYSpc 2.10軟件計算種質間遺傳相似系數(表5)，結果顯示，來自不同地區的26份海州常山的遺傳相似系數在0.285 1～0.690 9之間，平均為0.518 0。其中山東泰安馬套村和泰安夏張鎮2個種源間的相似系數最大(0.690 9)，甘肅天水和云南昭通間的相似系數最低(0.285 1)。據統計，遺傳相似系數在0.400 0～0.600 0之間的占種源總數的81.58%；遺傳相似系數小于0.400 0的占7.69%；遺傳相似系數大于0.600 0的占10.46%。另外從相似系數矩陣可知：來自同一省份或者相近地域的種源之間相似系數較大，例如來自山東省、河南省、江蘇省的種源之間相似系數偏高。由遺傳相似系數分析可知，供試材料之間的遺傳相似性與地理距離存在顯著的相關性，地理距離越遠，遺傳相似性越小，遺傳距離越大，基因間的交流越少。反之，遺傳相似性越大，材料間的遺傳距離越小，基因交流越頻繁。

表4 基于不同引物組合的海州常山遺傳多樣性水平

注：同列數據后標有不同大寫字母表示在0.01水平上差異顯著。

2.3 不同海州常山種質資源的聚類分析

根據相似性系數進行UPGMA聚類分析，在相似系數為0.534處可以將所有種源海州常山劃分為7類(圖1)：第一類包括2個種源，分別為山西太原和甘肅天水，第二類陜西楊凌單獨為一類，第三類包括19份種質資源，在相似性系數0.57處切割。可將第三類群劃分為4個亞群(A、B、C、D)，A亞群包括11個種源，其中在11份種源中，山東的占有8份，其他3份分別為山東省周邊省份；B亞區包括1份種源，為遼寧大連；C亞區包括3份種源，分別為安徽舒城、江蘇連云港、江蘇南京；D亞區包括4份種源，分別為湖北神農架、河南新縣、河南西峽、浙江天目山。廣西臨桂縣、云南昭通、重慶金佛山、貴州望謨這4個種源可能由于分別地處熱帶和亞熱帶的交界、熱帶、亞熱帶、亞熱帶，加上地理位置相差較大，在聚類圖上分別單獨聚為一類。

3 討論

3.1 AFLP標記的檢測有效性及海州常山的遺傳多樣性分析

在植物遺傳多樣性研究中AFLP標記技術已在農作物、花卉、樹木等植物中廣泛應用[16-18]。例如野生扁蓿豆[19]、雞冠花[10]、枸杞[20]、紫椴[21]等植物遺傳多樣性的研究都采用AFLP標記技術。本研究篩選出8對AFLP引物對26份來自不同地理區域的海州常山進行擴增，共檢測出1 042條帶，其中多態性條帶1 030條，多態性位點比例98.85%。另由多樣性參數可知：Na為1.562 5個，Ne為1.226 0個，H、I分別為 0.142 0、0.225 5，這與紫椴、甘蔗[21-22]等作物的研究類似，表明26份海州常山種質間有豐富的遺傳多樣性，這為海州常山的資源開發利用奠定了基礎。植物的遺傳多樣性水平與其生物學特性、環境、分布范圍、花粉和種子傳播方式等因素有關[23]，本試驗中的26份種源遺傳多樣性豐富，可能是由于種源采自全國不同地區，這充分表明我國海州常山種質資源具有豐富的遺傳基礎。

3.2 國內主要分布區的海州常山親緣關系分析

在來自不同地區的26份海州常山種質資源中，其相似系數在0.285 1～0.690 9之間，來自不同省份的海州常山種質資源間相似系數相對較小，這一趨勢與對紫花苜蓿[24]、白花泡桐[25]、甘蔗[22]種質資源間遺傳相似系數的分析相似，可知來自不同省(區、市)的海州常山種質資源間的親緣關系相對較遠，基因交流較少。聚類分析表明，劃分類群與地理起源明顯相關，例如來自山東、河南、江蘇各地區的種源多數聚為一類或者聚為一亞類，而來自地理距離較大的廣西臨桂縣、云南昭通、重慶金佛山、貴州望謨這4個種源各自單獨聚為一類，表明這4個種源與其他材料間的親緣關系相對較遠，具有相對獨立的遺傳特性。親本間的親緣關系在很大程度上決定著后代群體的選擇范圍，通常認為2個親本遺傳差異越大，后代分離范圍就越廣泛，獲得優良個體的機會也就越多。從聚類分析可知，地理位置分布差異較大的幾個海州常山種源可考慮作為雜交親本，為海州常山今后育種提供科學依據。

由于對海州常山種質資源的多樣性研究剛剛開始，本研究在海州常山種質資源多樣性研究中存在一些不足，例如不同地區采樣的數量不均，而且本試驗只用了AFLP技術，簡單重復序列標記(simple sequence repeats，簡稱SSR)、相關序列擴增多態性(sequence-related amplified polymorphism，簡稱SRAP)等分子標記技術還未用于海州常山種質資源的遺傳多樣性的分析。下一步將采集樣品較少地區的種質資源，并采用其他分子標記技術對其遺傳多樣性進行分析，尋找適宜該樹種遺傳多樣性分析的分子標記技術，進一步確定海州常山不同地區種質資源的親緣關系。

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