豌豆根瘤菌高效菌株的篩選

潘亭亭， 王 樂， 姚紅麗， 劉忠寬， 曹衛東， 劉朋飛， 劉曉云

(1.河北大學生命科學學院/河北省微生物多樣性研究與應用重點實驗室，河北保定 071002；2.河北省農林科學院農業資源環境研究所，河北石家莊 050051； 3.中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京 100081)

豌豆(PisumsativumL.)多為一年生或多年生的攀緣或矮生草本植物，是家喻戶曉的豆類糧食作物，又名蜜豆、青豆等。豌豆因富含蛋白質、脂肪、粗纖維以及維生素B1、維生素B2、維生素C等多種營養成分，具有豐富多樣的使用價值[1-2]，其栽培面積和產量僅次于大豆、花生和菜豆[3]。根據聯合國糧食及農業組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations，簡稱FAO)統計資料，2005年全世界有88個國家生產干豌豆，栽培面積約為658萬hm2，總產量約為 1 126萬t[4]。中國是世界上第三大干豌豆生產國和第二大青豌豆生產國，干豌豆生產主要分布在云貴川、江浙、湖北和北方一些省(市)[5]。但是我國與世界豌豆主產國相比，土壤產率較低[2]，如何提高我國豌豆的產量和質量成為當今亟須解決的難題。除選用良種及改進栽培技術是提高豌豆產量的重要途徑[6]外，豌豆生產中的肥料合理施用也是比較關鍵的環節。豌豆可以與相應的根瘤菌形成共生關系從而將空氣中的游離態氮固定，滿足自身營養所需，所以基本不需要施用氮素或少施氮肥。自然生長的豌豆具有根瘤著生，但其數量有限，而且固氮能力有限。接種適宜的根瘤菌可以大大提高豌豆的結瘤固氮能力，為自身生長提供必需的氮素營養，達到增產的目的[7-9]。豌豆根瘤菌的多樣性，為豌豆生產提供了可備選擇的根瘤菌資源[10-11]。Palmer等研究表明，可耕種的土壤中的豌豆根瘤菌多樣性比草地中的多樣性要高[12]。但是，根瘤菌的共生固氮效率既與參與固氮的根瘤菌和植物基因有關，又受到生態環境(如土壤環境與肥力、pH值、溫度等)的影響[13]。因此，篩選與植株匹配性較高、能高效固氮的菌株尤為關鍵。中國科學院南京土壤研究所根瘤菌組等通過豌豆根瘤菌拌種，發現人工接種根瘤菌能夠明顯改善豌豆的結瘤情況；一些根瘤菌菌株R12、R20、R21、ACCC16101與ACCC16103，可以顯著增加豌豆根瘤數量、根生物量及植株地上部分干質量，并獲得接種用的菌株[14-16]。張虎天等通過對豌豆-玉米間作體系接種根瘤菌，使土壤含氮量和植株氮素積累量最大，分別增加37.4%和17.4%，并提高了體系中作物根際的細菌數量[17]。本研究以滄州南大港鹽堿土為植株主要生長介質，以花葉豌豆為研究對象，旨在篩選出與花葉豌豆高效固氮且耐鹽堿的根瘤菌菌株，提高豌豆產量，改善土壤營養狀況。

1 材料與方法

1.1 材料

供試土壤為鹽堿土，采自河北省滄州市南大港六分區27隊，土壤理化性質見表1。

供試作物為花葉豌豆(PisumsativumL.)，由河北省農林科學院農業資源環境研究所劉振宇贈與。供試菌種引自河北大學微生物多樣性研究與應用重點實驗室，共18株。

YMA固體培養基的配方：K2HPO40.25 g/L，KH2PO40.25 g/L，甘露醇10 g/L，酵母粉0.8 g/L，MgSO40.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，瓊脂粉14 g/L。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培養 將供試菌種接種在YMA固體培養基上活化，然后將菌種接種到YMA固體斜面培養基上，28 ℃培養3 d，用100 mL無菌水洗下菌體，裝進無菌三角瓶中搖床振蕩15 min，利用分光光度計測其菌懸液的D600 nm。當D600 nm>0.5后進行接種。

1.2.2 土壤處理 將土壤壓碎去雜，按照V土壤∶V沙=4 ∶1，將土壤和沙充分混勻，稱取1.0 kg置于種植花盆(20 cm口徑)中，種植前適量澆水，使土壤浸潤，保持一定濕度。

表1 土壤理化性質

1.2.3 種子處理 挑選飽滿未破損的豌豆種子，依次用95%乙醇浸泡5 min，無菌水沖洗5～7次；用濃硫酸浸泡 2 min，無菌水沖洗5～7次；用5%次氯酸鈉浸泡5 min，無菌水沖洗5～7次后，將種子均勻放置于裝有潤濕濾紙的無菌培養皿中，28 ℃避光發芽，每隔12 h換新鮮無菌水，當大部分豌豆芽長到1.5～2.0 cm時，選取萌芽整齊且胚根垂直的種子進行栽培。栽培前，用相應根瘤菌懸液浸泡發芽種子一段時間。

1.2.4 土壤篩選試驗 將發芽的豌豆根部朝下，用無菌鑷子夾取，植入花盆中，每盆種植5顆，再在豌豆種子處接入根瘤菌菌液2 mL，并用塑料薄膜封閉盆口。每個處理設5個重復，以不接菌作為空白對照。然后將豌豆移置于溫室中進行培養，待幼苗長出時，將塑料薄膜劃開小口。每隔一段時間澆無菌水1次。待豌豆長出第3張葉時定苗，每盆3株。生育期的管理結合土培試驗的要求和豌豆植株生長的需要，在合理的時期搭好支架，防止豌豆倒伏。

1.2.5 收獲 待植株生長48 d后進行收獲，同時進行結瘤數、株高(從子葉痕處至離生長點最近的展開葉頂端)、地上部分干質量(以第1張葉葉痕處為劃分標準，植物樣品先在烘箱中于105 ℃殺青2 h，然后于65 ℃烘干至恒質量)、開花結莢情況的統計測定。

1.3 數據處理與統計分析

通過統計軟件SPSS 13.0對試驗數據進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，在滿足方差齊性的情況下，利用Tukey檢驗進行多重比較，確定各因子水平內部不同水平平均值之間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 接種不同根瘤菌對豌豆生長性狀的影響

由表2可知，接種根瘤菌菌株對豌豆干質量、結瘤數及株高影響均極顯著。由表3可知，接種不同的根瘤菌菌株均對豌豆干質量有影響，在供試的18株菌中，豌豆干質量增幅明顯的為Hbu610006、Hbu610015，相比空白對照分別增產82.35%、79.41%，差異達顯著水平；接種不同根瘤菌對豌豆結瘤數影響顯著，與對照相比，均有不同程度的增加，其中表現較好的有Hbu610005、Hbu610015等8株，分別比對照增加235.77%、231.20%等，與其他多數菌株具有顯著差異；對株高影響較大的為Hbu610018、Hbu610002，比空白對照分別增加 16.82%、15.64%，其次為Hbu610006、Hbu610003、Hbu610015、Hbu610007，分別比對照增加15.02%、14.12%、13.75%、13.47%。

2.2 接種不同根瘤菌菌株對豌豆開花、結莢的影響

由表4可知，接種不同的根瘤菌菌株對豌豆開花、結莢的影響不同。與對照相比，接種根瘤菌均在不同程度上增加了豌豆開花、結莢的數量，其中Hbu610006和Hbu6100015表現較好。Hbu610015的平均結莢數為1.1個/株，且42.86%的果莢莢長達到4.0 cm，其花苞數也達到0.8個/株。Hbu610006的果莢大小比較均一，豆莢長大多為2～3 cm，其平均花苞數達到 1.0個/株左右。而且，由表3可知，Hbu610006、Hbu610015的植株干質量增幅明顯，Hbu610015的根瘤數比對照明顯增加，Hbu610006、Hbu610015的株高僅次于Hbu610018、Hbu610002(除Hbu610003略高于Hbu610015)?？梢?，植株的開花結莢數與干質量、結瘤數等性狀表現一致，可作為篩選高效菌株的輔助參考指標。

表2 不同根瘤菌菌株對豌豆生長性狀影響的方差分析

表3 接種不同根瘤菌菌株后地上部分干質量、株高和結瘤數

注：根據Tukey檢驗，同列數據后不同小寫字母表示不同處理間在0.05水平上差異顯著。

表4 接種不同根瘤菌后豌豆開花、結莢的數量

3 結論與討論

根瘤菌與豆科植物的共生具有宿主多樣性與專一性的特點。接種不同的根瘤菌后，與豌豆共生匹配性能較好的菌株，使豌豆在不同的生長性狀方面表現出明顯的優勢。本試驗中，接種高效的根瘤菌Hbu610006和Hbu610015后，使豌豆干質量、根瘤數等增加，結莢開花數增多，成熟期提前，最終表現出增產的效果，這與Liu等的研究結果[18]一致。在探究根瘤菌競爭結瘤機制的研究中，肖文麗研究發現，與大豆共生固氮能力較強的菌株4534比共生能力較差的菌株4222產生更多的蛋白響應，這些蛋白主要是代謝相關蛋白、轉運蛋白和鞭毛蛋白等[19]。

河北省滄州市屬于濱海鹽堿地區，可耕種土地極少，大部分為鹽堿耕地。據2006年統計[20]，黃驊輕度鹽堿耕地 2.46萬hm2，占耕地總面積的27.01%，中度鹽堿耕地 1.14萬hm2，占耕地總面積的12.55%，重度和極度鹽堿耕地 5 260 hm2，占耕地總面積的5.77%，其中絕大多數屬于中、低產田，若這些土地能被充分利用，將是增加糧食總產量的寶貴土壤資源[21-24]。將根瘤菌接種到花葉豌豆根部，可通過固氮作用為植物提供所需要的氮素。此外，根瘤菌通過分泌有機酸、氨基酸、酶等可增加植物對營養物質的吸收，促進植物生長[25]；通過分泌植物激素、維生素、鐵載體等可提高植物的生物量[26]。在本試驗中，為充分發揮高效根瘤菌的共生固氮在農業生產實踐中的經濟價值和生態效益，選擇鹽堿土種植豌豆，通過豌豆與適宜根瘤菌的相互作用，豌豆植株可獲得生長所需的大部分氮素，長勢良好，并能增加土壤中根瘤菌及其他微生物的數量，明顯改善土壤營養狀況。在豌豆根瘤菌對酸堿和鹽分的適應性研究中，謝軍紅等也指出，菌株的鹽堿忍耐能力因菌株而異[16]。在花葉豌豆結瘤試驗中，發現不同根瘤菌菌株對豌豆的干質量、開花結莢情況影響不同。因此，將豌豆-根瘤菌的共生固氮作用與鹽堿土營養匱乏巧妙、有力地結合在一起，能夠充分利用前者的優勢，改善鹽堿土的耕種情況，提高鹽堿土的經濟價值，為農業生產帶來可觀收益。

從供試菌株對豌豆生長性狀影響的綜合指標來看，Hbu610006和Hbu610015的表現優于其他菌株，與供試豌豆品種匹配性較好，可作為與花葉豌豆高效共生的菌株。

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