染色體8q拷貝數(shù)變異與肝細(xì)胞癌患者術(shù)后總生存期的相關(guān)性及其靶基因篩選

趙昆，徐菊英，許青，，朱忠政

本研究創(chuàng)新點(diǎn)：

（1）本研究首次發(fā)現(xiàn)染色體8q24.13-24.3增益是肝細(xì)胞癌（HCC）患者術(shù)后總生存期（OS）的影響因素，有助于在HCC診斷早期對(duì)HCC患者的預(yù)后進(jìn)行判斷，為早期臨床干預(yù)和個(gè)體化治療提供依據(jù)。（2）染色體8q24.13-24.3增益片段內(nèi)ATAD2、PVT1、NDRG1呈拷貝數(shù)依賴性表達(dá)上調(diào)，可能參與了HCC不良預(yù)后的演進(jìn)過程，為可能的分子靶向治療提供了潛在靶點(diǎn)。

我國(guó)肝細(xì)胞癌（HCC）的死亡率為422.1/10萬，占所有惡性腫瘤的第三位［1］。盡管目前手術(shù)、放療、化療和分子靶向治療有所進(jìn)展，但HCC患者的預(yù)后仍然很差。目前尚缺乏在診斷初期對(duì)HCC患者的預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè)的可靠的預(yù)后評(píng)估體系，因此篩選可以預(yù)測(cè)HCC預(yù)后的分子標(biāo)志物具有重要意義［2］。拷貝數(shù)變異（CNA）即基因組DNA的片段性增益和丟失，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可作為篩選預(yù)測(cè)HCC預(yù)后的標(biāo)志物的有效途徑［3-4］。既往研究報(bào)道，染色體8q增益與口腔癌、乳腺癌、腎癌、前列腺癌、葡萄膜黑色素瘤等腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)［5-9］，并且與HCC的臨床病理學(xué)特征如腫瘤直徑大、分化差、分期高相關(guān)［10-12］，但有關(guān)染色體8q增益與HCC預(yù)后的關(guān)系目前仍不清楚。為此，本研究探討染色體8q CNA與HCC患者術(shù)后總生存期（OS）的相關(guān)性并篩選預(yù)后相關(guān)潛在靶基因，以期在診斷初期對(duì)HCC患者的預(yù)后進(jìn)行判斷，從而對(duì)預(yù)后不良患者進(jìn)行特殊干預(yù)和個(gè)體化治療。

1 對(duì)象與方法

1.1 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：行根治性切除術(shù)，病理證實(shí)為HCC；術(shù)前未行放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：病理證實(shí)伴肝內(nèi)膽管癌成分、癌組織中癌細(xì)胞占比＜80%或癌旁肝組織過少。

1.2 研究對(duì)象 收集2007—2008年于第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院手術(shù)住院的HCC患者187例為研究對(duì)象。其中男148例，女39例；年齡19～79歲，平均年齡（51.3±12.8）歲。收集所有患者癌組織，標(biāo)本離體30 min內(nèi)液氮冷凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩１狙芯拷?jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.3 一般資料收集 記錄患者性別、年齡、術(shù)后甲胎蛋白（AFP）水平、肝功能Child-Pugh分級(jí)、肝硬化情況、糖尿病史、Edmondson-Steiner分級(jí)、有無完整腫瘤包膜、TNM分期。

1.4 染色體8q CNA檢測(cè)與數(shù)據(jù)處理 采用Qiagen抽提純化試劑盒（Qiagen公司）提取癌組織基因組DNA。采用Agilent 244K（Hu-244A，Agilent公司）微陣列比較基因組雜交（aCGH）技術(shù)檢測(cè)染色體8q CNA。該平臺(tái)在染色體8q共包含7 487個(gè)寡核苷酸探針，DNA分辨率高達(dá)13.23 kb。采用Agilent G2565BA微陣列掃描儀對(duì)芯片進(jìn)行掃描，采用Feature Extraction 9.5進(jìn)行數(shù)據(jù)提取。利用R統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包DNAcopy對(duì)全部樣本進(jìn)行基于探針log2比值比（癌組織與正常組織DNA拷貝數(shù)比值的log2對(duì)數(shù)）的染色體8q片段循環(huán)二元分割，每一分割片段的log2比值比被賦予該片段內(nèi)所有探針log2比值比的平均值。只有5個(gè)或5個(gè)以上的連續(xù)探針發(fā)生同向變異才能定義為一個(gè)變異片段。片段log2比值比＞0.5定義為CNA增益；片段log2比值比為-0.5～0.5定義為CNA穩(wěn)定（即CNA無增益/丟失）；片段log2比值比＜-0.5定義為CNA丟失。依據(jù)UCSC公共數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//genome.ucsc.edu，NCBI35/hgl7）定位探針序列和基因。

1.5 染色體8q24.13-24.3片段內(nèi)50個(gè)已知基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)與數(shù)據(jù)處理 采用TRIZOL一步法（Invitrogen公司）提取癌組織總RNA。分別采用QIAGEN RNAeasy kit和QIAGEN Oligotex Direct mRNA kit（Qiagen公司）進(jìn)行總RNA純化和Poly（A）+mRNA提取。采用Affymetrix U133 Plus 2.0寡核苷酸基因芯片（Affymetrix公司）檢測(cè)染色體8q24.13-24.3片段內(nèi)50個(gè)已知基因mRNA表達(dá)水平。采用Gene array Scanner 3000 7G激光共聚焦掃描系統(tǒng)（Affymetfix公司）對(duì)雜交后芯片進(jìn)行信號(hào)掃描，利用GCOS 1.4軟件讀取數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)預(yù)處理及歸一化采用R統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包affy中的GCRMA法。基因mRNA表達(dá)水平以log2比值比表示。

1.6 隨訪 術(shù)后采用病歷結(jié)合電話隨訪方式進(jìn)行隨訪，每1～6個(gè)月隨訪1次，末次隨訪時(shí)間為2016-12-31。隨訪時(shí)間2.6～108.6個(gè)月，中位隨訪時(shí)間45.0個(gè)月。最終共66例患者完成隨訪，其中52例因HCC死亡。OS定義為手術(shù)至因HCC死亡或末次隨訪時(shí)的時(shí)間間隔。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Stata 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（）表示，計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；一般資料、染色體8q內(nèi)各高頻CNA（增益發(fā)生率＞20%）片段與OS的相關(guān)性分析采用Log-rank檢驗(yàn)；采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析OS的影響因素；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，其比較采用Log-rank檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CNA增益HCC患者和CNA無增益HCC患者基因mRNA表達(dá)水平比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，以P＜0.000 1為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC患者一般資料與OS的相關(guān)性 HCC患者性別、年齡、術(shù)后AFP水平、肝功能Child-Pugh分級(jí)、肝硬化情況、Edmondson-Steiner分級(jí)與OS均無相關(guān)性（P＞0.05）；HCC患者糖尿病史、有無完整腫瘤包膜、TNM分期與OS有相關(guān)性（P＜0.05，見表1）。

2.2 染色體8q內(nèi)各高頻CNA片段與OS的相關(guān)性 完成隨訪的66例患者中，染色體8q全臂或部分增益22例（33.3%）。染色體8q片段循環(huán)二元分割結(jié)果顯示，高頻CNA片段共5個(gè)，分別定位于為染色體8q13.3-21.3、染色體8q21.3-23.3、染色體8q23.3-24.13、染色體8q24.13-24.3和染色體8q24.3（見表2）。

以O(shè)S為因變量（連續(xù)性變量），分別以染色體8q13.3-21.3、染色體8q21.3-23.3、染色體8q23.3-24.13、染色體8q24.13-24.3和染色體8q24.3為自變量（賦值：無增益=0，增益=1），進(jìn)行單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析，結(jié)果顯示，染色體8q24.13-24.3增益與OS有相關(guān)性（P＜0.05，見表2）。

表1 HCC患者一般資料與OS的相關(guān)性Table 1 Association of general clinicopathological factors with overall survival

以O(shè)S為因變量（連續(xù)性變量），以染色體8q24.13-24.3（賦值：無增益=0，增益=1）、性別（賦值：女=0，男=1）、年齡（賦值：≤50歲=0，＞50歲=1）、術(shù)后AFP水平（賦值：≤20 μg/L=0，＞20 μg/L=1）、肝功能Child-Pugh分級(jí)（賦值：A級(jí)=0，B級(jí)=1）、肝硬化情況（賦值：無=0，有=1）、有無糖尿病史（賦值：無=0，有=1）、Edmondson-Steiner分級(jí)（賦值：Ⅱ級(jí)=0，Ⅲ級(jí)=1）、有無完整腫瘤包膜（賦值：無=0，有=1）、TNM分期（賦值：Ⅰ/Ⅱ期=0，Ⅲ期=1）為自變量，進(jìn)行多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析，結(jié)果顯示，染色體8q24.13-24.3增益、有無糖尿病史、有無完整腫瘤包膜、TNM分期是OS的影響因素（P＜0.05，見表3）。

生存分析結(jié)果顯示，染色體8q24.13-24.3增益HCC患者生存率低于染色體8q24.13-24.3無增益HCC患者（χ2=6.56，P=0.010，見圖1）。

2.3 染色體8q24.13-24.3增益片段內(nèi)的差異表達(dá)基因

為進(jìn)一步探討染色體8q24.13-24.3增益片段內(nèi)與OS相關(guān)的潛在靶基因，本研究組針對(duì)具有配對(duì)aCGH和mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)的109例患者，比較染色體8q24.13-24.3增益HCC患者（n=29）與染色體8q24.13-24.3無增益HCC患者（n=80）染色體8q24.13-24.3片段內(nèi)50個(gè)已知基因mRNA表達(dá)水平的差異，結(jié)果顯示，染色體 8q24.13-24.3增益 HCC患者 C8orf76、ATAD2、WDYHV1、FBXO32、TMEM65、TATDN1、ZNF572、SQLE、KIAA0196、NSMCE2、PVT1、FAM49B、ASAP1、NDRG1、ZFAT、KHDRBS3、EIF2C2 mRNA 表達(dá)水平高于染色體8q24.13-24.3無增益HCC患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1）；染色體8q24.13-24.3增益HCC患者與染色體8q24.13-24.3無增益HCC患者 FAM83A、TRIB1、PHF20L1、ST3GAL1、PTK2、NDUFB9、TRMT12、FAM91A1、GPR20、COL22A1、MTSS1、TSNARE1、EFR3A、SLC45A4、TG、GSDMC、ZHX1、TMEM71、MYC、ANXA13、FAM135B、HHLA1、WISP1、KCNK9、RNF139、LRRC6、DENND3、CCDC26、CHRAC1、NCRNA00051、TRAPPC9、FAM84B、KCNQ3 mRNA表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.000 1，見表4）。

表2 染色體8q高頻CNA片段及其與HCC患者術(shù)后OS的相關(guān)性Table 2 Association of high-frequency CNA（s） in chromosome 8q with overall survival in patients with hepatocellular carcinoma

表3 HCC患者術(shù)后OS影響因素的多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析Table 3 Multiple Cox regression analysis of the associated factors for overall survival in patients with hepatocellular carcinoma

圖1 染色體8q24.13-24.3增益HCC患者與染色體8q24.13-24.3無增益HCC患者生存曲線分析Figure 1 Survival curve of hepatocellular carcinoma patients with 8q24.13-24.3 gain and those without

3 討論

近年來有關(guān)染色體CNA與腫瘤預(yù)后的相關(guān)性研究備受關(guān)注。染色體8q增益作為惡性腫瘤常見分子事件，與多種腫瘤預(yù)后相關(guān)，但其與HCC預(yù)后的相關(guān)性尚不清楚。為此，本研究探討染色體8q CNA與HCC患者術(shù)后OS的相關(guān)性并篩選預(yù)后相關(guān)潛在靶基因，以期在診斷初期對(duì)HCC患者的預(yù)后進(jìn)行判斷，從而對(duì)預(yù)后不良患者進(jìn)行特殊干預(yù)和個(gè)體化治療。

染色體8q增益頻繁發(fā)生于包括HCC在內(nèi)的多種惡性腫瘤，且與HCC腫瘤大、分化差、分期高相關(guān)［10-12］。本研究單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析結(jié)果顯示，染色體8q24.13-24.3增益與OS有相關(guān)性。既往研究報(bào)道，染色體8q增益與口腔癌、乳腺癌、腎癌、前列腺癌、葡萄膜黑色素瘤等患者的不良預(yù)后相關(guān)［5-9］。這些研究結(jié)果共同提示，染色體8q增益可能是多種腫瘤的不良預(yù)后因素，因此其與其他腫瘤的預(yù)后關(guān)系值得進(jìn)一步研究。VINCENT-CHONG等［5］報(bào)道口腔癌不良預(yù)后相關(guān)的染色體8q增益片段定位于染色體8q22.3-23.1；HAMMOND等［9］報(bào)道葡萄膜黑色素瘤不良預(yù)后相關(guān)的染色體8q增益最小關(guān)鍵區(qū)域定位于染色體8q22.1-8qter；而本研究多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析結(jié)果顯示，染色體8q24.13-24.3增益是OS的影響因素。以上結(jié)果共同提示，不良預(yù)后相關(guān)的染色體8q增益最小關(guān)鍵區(qū)域具有腫瘤類型特異性，可能反映了不同類型腫瘤在預(yù)后相關(guān)基因譜的差異。一項(xiàng)關(guān)于乳腺癌的研究顯示，染色體8q增益與以紫杉醇為基礎(chǔ)的新輔助化療耐藥有關(guān)［13］。未來需進(jìn)一步研究驗(yàn)證在染色體8q24.13-24.3增益HCC患者中是否存在同樣的化療耐藥性及其影響HCC患者OS的程度。

腫瘤DNA片段性增益的生物學(xué)效應(yīng)主要是通過片段內(nèi)重要腫瘤相關(guān)基因的拷貝數(shù)依賴性表達(dá)上調(diào)實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果顯示，染色體8q24.13-24.3增益HCC 患 者 C8orf76、ATAD2、WDYHV1、FBXO32、TMEM65、TATDN1、ZNF572、SQLE、KIAA0196、NSMCE2、PVT1、FAM49B、ASAP1、NDRG1、ZFAT、KHDRBS3、EIF2C2 mRNA表達(dá)水平高于染色體8q24.13-24.3無增益HCC患者，提示其中某（些）基因可能驅(qū)動(dòng)了染色體8q24.13-24.3的增益，并在HCC患者不良預(yù)后中發(fā)揮重要作用。ATAD2作為染色體8q24片段增益的驅(qū)動(dòng)基因，其編碼的ATAD2蛋白在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡等多種細(xì)胞生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，且ATAD2蛋白過表達(dá)與HCC的不良預(yù)后相關(guān)［14-15］。PVT1是一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA，其通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和耐藥性來促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展［16］，其過表達(dá)與包括HCC在內(nèi)的多種腫瘤不良預(yù)后相關(guān)［17-21］。NDRG1基因編碼的NDRG1蛋白屬于α/β水解酶超家族成員，其過表達(dá)更常見于侵襲性、轉(zhuǎn)移性高且生存率低的HCC患者中［22-23］。目前尚缺乏其他基因相關(guān)研究，筆者推測(cè)針對(duì)這些基因進(jìn)行相關(guān)功能學(xué)研究將有助于理解基因上調(diào)與染色體8q24.13-24.3增益的因果關(guān)系及其在HCC患者預(yù)后中的作用。

表4 染色體8q24.13-24.3增益HCC患者與染色體8q24.13-24.3無增益HCC患者染色體8q24.13-24.3片段內(nèi)50個(gè)已知基因mRNA表達(dá)水平比較Table 4 Comparison of the mRNA expression level of 50 known genes in chromosome 8q24.13-24.3 segment between hepatocellular carcinoma patients with 8q24.13-24.3 gain and those without

本研究存在以下局限性。首先，本研究中HCC患者的樣本量相對(duì)較小，尤其是染色體8q CNA與OS的相關(guān)性分析僅涉及66例患者，未來需進(jìn)一步在更大樣本量的基礎(chǔ)上進(jìn)行驗(yàn)證性研究。其次，雖然既往一些研究已表明，Affymetrix陣列分析結(jié)果與定量PCR分析結(jié)果具有一致性［24-25］，但本研究Affymetrix陣列分析檢測(cè)出的表達(dá)上調(diào)基因未經(jīng)其他方法驗(yàn)證。最后，被篩選出的差異表達(dá)基因未進(jìn)行體內(nèi)外功能學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。

綜上所述，染色體8q24.13-24.3增益與HCC患者OS有關(guān)，可作為HCC的一個(gè)預(yù)后預(yù)測(cè)因子。ATAD2、PVT1、NDRG1拷貝數(shù)依賴性表達(dá)上調(diào)可能參與了HCC不良預(yù)后的發(fā)生發(fā)展過程。

志謝：感謝第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院病理科董輝主治醫(yī)師在樣本收集和術(shù)后生存隨訪中給予的幫助。

作者貢獻(xiàn)：趙昆進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)收集，撰寫論文；徐菊英進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；朱忠政進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析、論文的修訂，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；許青對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。

［1］CHEN W，ZHENG R，BAADE P D，et al．Cancer statistics in China，2015［J］．CA Cancer J Clin，2016，66（2）：115-132．DOI：10.3322/caac.21338.

［2］PINATO D J，PIRISI M，MASLEN L，et al．Tissue biomarkers of prognostic significance in hepatocellular carcinoma［J］．Adv Anat Pathol，2014，21（4）：270-284．DOI：10.1097/PAP.0000000000000029.

［3］GU D L，CHEN Y H，SHIH J H，et al．Target genes discovery through copy number alteration analysis in human hepatocellular carcinoma［J］．World J Gastroenterol，2013，19（47）：8873-8879．DOI：10.3748/wjg.v19.i47.8873.

［4］Cancer Genome Atlas Research Network.Comprehensive and integrative genomic characterization of hepatocellular carcinoma［J］．Cell，2017，169（7）：1327-1341.e23．DOI：10.1016/j.cell.2017.05.046.

［5］VINCENT-CHONG V K，SALAHSHOURIFAR I，WOO K M，et al．Genome wide profiling in oral squamous cell carcinoma identifies a four genetic marker signature of prognostic significance［J］．PLoS One，2017，12（4）：e0174865．DOI：10.1371/journal.pone.0174865.

［6］MILIOLI H H，TISHCHENKO I，RIVEROS C，et al．Basallike breast cancer：molecular profiles，clinical features and survival outcomes［J］．BMC Med Genomics，2017，10（1）：19．DOI：10.1186/s12920-017-0250-9.

［7］KLATTE T，KROEGER N，RAMPERSAUD E N，et al．Gain of chromosome 8q is associated with metastases and poor survival of patients with clear cell renal cell carcinoma［J］．Cancer，2012，118（23）：5777-5782．DOI：10.1002/cncr.27607.

［8］EI GAMMAL A T，BRüCHMANN M，ZUSTIN J，et al．Chromosome 8p deletions and 8q gains are associated with tumor progression and poor prognosis in prostate cancer［J］．Clin Cancer Res，2010，16（1）：56-64．DOI：10.1158/1078-0432.CCR-09-1423.

［9］HAMMOND D W，AL-SHAMMARI N S，DANSON S，et al．High-resolution array CGH analysis identifies regional deletions and amplifications of chromosome 8 in uveal melanoma［J］．Invest Ophthalmol Vis Sci，2015，56（6）：3460-3466．DOI：10.1167/iovs.14-16215.

［10］OKAMOTO H，YASUI K，ZHAO C，et al．PTK2 and EIF3S3 genes may be amplification targets at 8q23-q24 and are associated with large hepatocellular carcinomas［J］．Hepatology，2003，38（5）：1242-1249．DOI：10.1053/jhep.2003.50457.

［11］CHOCHI Y，KAWAUCHI S，NAKAO M，et al．A copy number gain of the 6p arm is linked with advanced hepatocellular carcinoma：an array-based comparative genomic hybridization study［J］．J Pathol，2009，217（5）：677-684．DOI：10.1002/path.2491.

［12］LIU Y J，ZHOU Y，YEH M M.Recurrent genetic alterations in hepatitis C-associated hepatocellular carcinoma detected by genomic microarray：a genetic，clinical and pathological correlation study［J］．Mol Cytogenet，2014，7（1）：81．DOI：10.1186/s13039-014-0081-8.

［13］HAN S，PARK K，SHIN E，et al．Genomic change of chromosome 8 predicts the response to taxane-based neoadjuvant chemotherapy in node-positive breast cancer［J］．Oncol Rep，2010，24（1）：121-128.

［14］HWANG H W，HA S Y，BANG H，et al．ATAD2 as a poor prognostic marker for hepatocellular carcinoma after curative resection［J］．Cancer Res Treat，2015，47（4）：853-861．DOI：10.4143/crt.2014.177.

［15］WU G，LU X，WANG Y，et al．Epigenetic high regulation of ATAD2 regulates the Hh pathway in human hepatocellular carcinoma［J］．Int J Oncol，2014，45（1）：351-361．DOI：10.3892/ijo.2014.2416.

［16］COLOMBO T，F(xiàn)ARINA L，MACINO G，et al．PVT1：a rising star among oncogenic long noncoding RNAs［J］．Biomed Res Int，2015，2015：304208．DOI：10.1155/2015/304208.

［17］DING C，YANG Z，LV Z，et al．Long non-coding RNA PVT1 is associated with tumor progression and predicts recurrence in hepatocellular carcinoma patients［J］．Oncol Lett，2015，9（2）：955-963．DOI：10.3892/ol.2014.2730.

［18］CHI S，SHEN L，HUA T，et al．Prognostic and diagnostic significance of lncRNAs expression in cervical cancer：a systematic review and meta-analysis［J］．Oncotarget，2017，8（45）：79061-79072．DOI：10.18632/oncotarget.18323.

［19］CHEN J，LI Y，ZHENG Q，et al．Circular RNA profile identifies circPVT1 as a proliferative factor and prognostic marker in gastric cancer［J］．Cancer Lett，2017，388：208-219．DOI：10.1016/j.canlet.2016.12.006.

［20］SONG J，WU X，LIU F，et al．Long non-coding RNA PVT1 promotes glycolysis and tumor progression by regulating miR-497/HK2 axis in osteosarcoma［J］．Biochem Biophys Res Commun，2017，490（2）：217-224．DOI：10.1016/j.bbrc.2017.06.024.

［21］HUANG C，YU W，WANG Q，et al．Increased expression of the lncRNA PVT1 is associated with poor prognosis in pancreatic cancer patients［J］．Minerva Med，2015，106（3）：143-149.

［22］SONG Y，CAO L.N-myc downstream-regulated gene 1：diverse and complicated functions in human hepatocellular carcinoma（review）［J］．Oncol Lett，2013，6（6）：1539-1542．DOI：10.3892/ol.2013.1636.

［23］CHENG J，XIE H Y，XU X，et al．NDRG1 as a biomarker for metastasis，recurrence and of poor prognosis in hepatocellular carcinoma［J］．Cancer Lett，2011，310（1）：35-45．DOI：10.1016/j.canlet.2011.06.001.

［24］SUN L，LIU T，ZHANG S，et al．Oct4 induces EMT through LEF1/β-catenin dependent WNT signaling pathway in hepatocellular carcinoma［J］．Oncol Lett，2017，13（4）：2599-2606．DOI：10.3892/ol.2017.5788.

［25］KATKOORI V R，SHANMUGAM C，JIA X，et al．Prognostic significance and gene expression profiles of p53 mutations in microsatellite-stable stage Ⅲ colorectal adenocarcinomas［J］．PLoS One，2012，7（1）：e30020．DOI：10.1371/journal.pone.0030020.