胎齡≤34周的漢族早產兒臍帶血內皮型一氧化氮合成酶基因多態性及其與早產兒主要并發癥的關系研究

常紹鴻，欒斌，張衛星

一氧化氮（NO）是人體重要的神經遞質和舒血管因子，對維持血壓穩定具有重要作用。內源性NO主要受一氧化氮合成酶的調節，其中內皮型一氧化氮合成酶（eNOS）是一氧化氮合成酶的一個亞型，大量研究證實eNOS基因多態性可改變NO產生水平，并與多種疾病的發生、發展有關［1-2］。國外有研究證實eNOS基因多態性與早產兒的主要并發癥有關，但結論并不一致［3-4］。目前，國內罕有這方面的研究，本研究以新鄉市漢族早產兒為研究對象，探討eNOS基因多態性與早產兒主要并發癥的關系，為精準醫療提供臨床證據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2014年2月—2016年12月于新鄉市中心醫院出生的早產兒，符合以下條件者入選本研究：（1）父母均為漢族，祖籍均為河南北部；（2）出生時胎齡≤34周。排除標準：（1）已知的先天性畸形，如先天性心臟病、先天性神經管發育異常等；（2）已知的染色體異常，如21-三體綜合征、18-三體綜合征等，以及明顯的面容異常伴有掌指紋異常者；（3）多胎。早產兒法定監護人了解本研究過程，并簽署書面同意書。最終入選早產兒231例。

1.2 觀察指標

1.2.1 產科記錄 包括孕周、母親分娩方式及新生兒的性別、出生體質量、5 min阿氏評分；產前行激素治療情況。

1.2.2 兒科記錄 包括患兒住院情況及主要并發癥、結局。

住院情況：肺表面活性物質（PS）應用、行有創機械通氣治療、發生低血壓或休克、發生敗血癥、發生動脈導管未閉、吸氧治療、發生呼吸暫停的情況。

主要并發癥：包括支氣管肺發育不良（BPD）、壞死性小腸結腸炎（NEC）、早產兒視網膜病（ROP）Ⅲ～Ⅴ期、腦室周圍-腦室內出血（PIVH）Ⅲ～Ⅳ級、需要行有創機械通氣治療的新生兒呼吸窘迫綜合征（RDS）。

BPD、NEC的診斷及分級依據《實用新生兒學》［5］。ROP的篩查時機、診斷標準和分期依據文獻［6］。PIVH確診主要依據顱腦超聲和顱腦MRI檢查結果，少數依據顱腦CT檢查結果［5］。RDS的診斷依據參考文獻［7］，當滿足以下條件之一時給予氣管插管、機械通氣治療：（1）頻繁呼吸暫停；（2）吸入氧濃度=0.6，且氧分壓＜50 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）或者經皮血氧飽和度＜85%（紫紺型先天性心臟病除外）；（3）二氧化碳分壓＞60～65 mm Hg，伴有酸中毒（pH＜7.20）。

考慮患者的臨床治療方法和預后不同，本研究僅對ROPⅢ～Ⅴ期、PIVH Ⅲ～Ⅳ級、需要行有創機械通氣治療的RDS的早產兒的診治資料進行分析。

結局分為死亡和未死亡。死亡病例是指住院時間超過72 h因病情嚴重而放棄治療，且放棄治療后8 h內死亡的早產兒；不包括家屬要求姑息治療且生后24 h內死亡的早產兒。

1.3 基因多態性測定 患兒均于臍帶結扎后立即取臍動脈血5 ml，采用北京天根公司基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，eNOS基因多態性位點的引物設計參照文獻［8］，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。rs2070744引物為：上游5'-GTGTACCCCACCTGCATTCT-3'，下 游 5'-CCCAGCAAGGATGTAGTGAC-3'；rs1799983 引物 為： 上 游 5'-CACTCCCCACAGCTCTGCAT-3'， 下游 5'-CAATCCCTTTGGTGCTCACG-3'；rs61722009引 物為： 上 游5'-CTATGGTAGTGCCTTGGCTGGAGG-3'， 下 游5'-ACCGCCCAGGGAACTCCGCT-3'。

1.4 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析。計量資料以（）表示，計數資料以相對數表示；采用單因素分析和多因素Logistic回歸分析分析各基因多態性與主要并發癥的關系。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料及主要結局 231例早產兒中男109例、女122例，出生體質量為（1 770.8±632.1）g。其中PIVH Ⅲ～Ⅳ級早產兒54例（23.4%），需要行有創機械通氣治療的RDS早產兒63例（27.3%），ROP Ⅲ～Ⅴ期早產兒32例（13.9%）。一般資料及主要結局見表1。

表1 231例早產兒部分一般資料及結局Table 1 Baseline data and main outcome of 231 Han premature infants of≤34 weeks' gestational age

2.2 最小等位基因頻率（MAF） 231例早產兒單核苷酸多態性（SNP）位點及基因型分布見表2。rs2070744 C MAF為0.145、rs1799983 T MAF為0.188、rs6172009 a MAF為0.159。本研究與Ensembl數據庫中的中國北京漢族（CHB）和中國南方漢族（CHS）［9-10］rs2070744和rs1799983 MAF比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見表3），提示本研究對象有代表意義。因Ensembl數據庫中缺乏中國漢族rs61722009基因型和等位基因數據，未進行相關比較。

2.3 單因素分析 單因素分析結果示rs2070744的TC+CC基因型和rs1799983的GT+TT基因型分別增加了BPD的發生率，差異有統計學意義（P＜0.05）；rs1799983 GT+TT基因型增加了ROP Ⅲ～Ⅴ期發生率（P＜0.05，見表4）。

2.4 多因素Logistic回歸分析 多因素Logistic回歸分析結果示rs2070744 TC+CC基因型為早產兒發生BPD的獨立危險因素（P＜0.05，見表5）；rs61722009 aa+ab基因型和rs1799983 GT+TT基因型同時存在是早產兒發生ROP Ⅲ～Ⅴ級發生的獨立危險因素（P＜0.05，見表6）。

表2 231例早產兒SNP位點及基因型分布〔n（%）〕Table 2 Distribution of SNP and genotypes in 231 Han premature infants of ≤34 weeks' gestational age

表3 本研究等位基因頻率與Ensembl數據庫已知數據比較〔n（%）〕Table 3 Allele frequency in this study versus known data in Ensembl genome database

表5 早產兒發生BPD影響因素的多因素Logistic回歸分析Table 5 Multiple Logistic regression analysis of the associated factors of BPD in 231 Han premature infants of ≤34 weeks' gestational age

表6 早產兒發生ROP Ⅲ～Ⅴ期影響因素的多因素Logistic回歸分析Table 6 Multiple Logistic regression analysis of the associated factors of stage Ⅲ - Ⅴ ROP in 231 Han premature infants of ≤ 34 weeks' gestational age

表4 基因型與早產兒主要并發癥的關系〔n（%）〕Table 4 Relationship between genotypes and the major complications of 231 Han premature infants of ≤34 weeks' gestational age

3 討論

隨著新生兒救護技術的提高，早產兒存活率明顯提高，同時早產兒相關的嚴重后果也越來越受到關注，并成為一個重要的社會問題。受早產兒自身發育的特點和醫療操作的影響，早產兒更容易發生全身和/或局部組織器官的血流動力學改變，有證據顯示這種血流動力學改變和多種早產兒嚴重并發癥相關［11-12］。

一氧化氮合成酶有3種同工酶，即內皮型、神經型和誘導型，其是不同基因編碼的結果，且作用于不同器官產生不同的病理生理作用［13］。eNOS在血管內皮細胞內產生內皮型一氧化氮（eNO），eNO是重要的舒血管因子，在維持血管張力的恒定和調節血壓穩定性中發揮重要作用。當血管受到血流沖擊，灌注壓突然升高時，可舒張動脈血管，降低全身動脈血壓，控制全身血管床的靜息張力，同時也可增加局部血流、抑制血小板和白細胞聚集、維持器官血流量的相對穩定。eNOS基因多態性普遍存在，共有10余種，研究證實，其中1種單核苷酸多態性與臨床各種疾病密切相關，分別是：（1）位于第4內含子區，有重復4次、5次兩種形式，稱為4b/a，在NCBI的序列號為rs61722009；（2）位于啟動子區的第786號位點的T置換為C，稱為T786C，在NCBI的序列號為rs2070744；（3）位于第7外顯子區的第894號位點的G置換為T，稱為G894T，在NCBI的序列號為rs1799983［14］。大量研究表明，eNOS基因多態性影響了人體內NO水平，從而影響多種疾病的發生發展過程［1-3］。

關于eNOS基因多態性與早產兒結局的關系，國外有研究發現早產兒腦癱的發生和eNOS基因多態性有關［15］，隨后多國學者對不同人群進行了范圍更廣的研究，RUSAI等［16］以105例出生體質量≤2 000 g且為ROP Ⅲ～Ⅴ期的早產兒為觀察組，127例同體質量患ROPⅠ～Ⅱ期的早產兒為對照組，研究發現eNOS基因4b/a多態性中，aa基因型為ROP Ⅲ～Ⅴ期的高危因素，與T786C無關。而YANAMANDRA等［17］研究卻發現T786C多態性明顯增加了ROP的發生率，其研究對象為146例美國早產兒，包括白種人和非裔美國人，該研究還報道等位基因C的基因頻率在白種人和非裔美國人之間有明顯區別，提示不同人種之間基因的差別可能是非裔美國人發生ROP的概率明顯小于白種人的原因。其他早產兒并發癥的研究也出現了不一致的現象，VANNEMREDDY等［3］研究124例非裔美國早產兒，結果提示T786C基因多態性是PIVH的獨立危險因素；一項來自波蘭波茲南醫科大學的研究卻認為T786C多態性與PIVH無關，而G894T多態性才是PIVH的高危因素［18］。不僅是人種不同而造成研究結果不同，DEMIRCUBUK等［19］研究結果顯示不同性別相同基因型患者患病率也不一樣，其研究對象為127例胎齡＜37周的土耳其患兒，測定rs1799983多態性，發現男性TT基因型和女性GG基因型更容易發生RDS。

本研究入選的患兒均為漢族，且祖籍均為河南北部，rs2070744和rs1799983基因型和等位基因頻率與Ensembl數據庫中的CHB、CHS已知資料比較［9-10］，均無明顯差異，說明本研究入選對象具有代表性，研究結果具有普遍意義。同時也說明取臍帶血測定新生兒基因多態性這種方法是可行的。本研究結果提示rs2070744 TC+CC基因型為發生BPD的獨立危險因素（P＜0.05），雖然單因素方差分析提示rs1799983 GT+TT基因型增加了BPD的發生率，但多因素Logistic回歸分析提示其并不是發生BPD獨立危險因素。佛羅倫薩卡雷吉大學醫院的研究結果與本研究不同，其認為rs2070744 TC+CC和rs1799983 GT+TT基因型均是BPD的高危因素［4］，其研究對象為342例胎齡≤28周的白種人早產兒，研究對象標準的不同可能是結果不同的原因。本研究中eNOS基因的3種單核苷酸多態性均不是ROP Ⅲ～Ⅴ期的高危因素，而rs61722009 aa+ab基因型和rs1799983 GT+TT基因型同時存在時，ROPⅢ～Ⅴ期發生率明顯增高（P＜0.05），與國外的研究有所不同［16-17］。至于需要行有創機械通氣治療的RDS、PIVHⅢ～Ⅳ級、NEC，均與這3種單核苷酸多態性無關。

本研究結果提示測定eNOS基因多態性有助于評估早產兒主要并發癥的發生風險，有助于臨床上精準醫療方法的選擇。同時，既往作為醫療廢物的臍帶血可以充分利用，尤其是對于可能患多種并發癥的早產兒來說，更具有可利用的價值。該研究的不足之處在于樣本量稍小，其結果仍需要不同人群更大樣本量的實驗數據的支持。

作者貢獻：常紹鴻進行文章的構思與設計，文章的可行性分析，文獻/資料收集、整理，撰寫論文；常紹鴻和張衛星進行論文的修訂和英文的修訂；欒斌負責文章選題指導、質量控制及審校、監督管理。

本文無利益沖突。

［1］MACCALLINI C，MOLLICA A，AMOROSO R.The positive regulation of eNOS signaling by PPAR agonists in cardiovascular diseases［J］．Am J Cardiovasc Drugs，2017，174（4）：273-281．DOI：10.1007/s40256-017-0220-9.

［2］馬瓊，楊文亮，郭華棋，等．內皮型一氧化氮基因（T786C）多態性與妊娠期高血壓疾病關系的meta分析［J］．中華圍產 醫 學 雜 志，2017，20（4）：299-303．DOI：10.3760/cma.j.issn.1007-9408.2017.04.012.MA Q，YANG W L，GUO H Q，et al．Association between endothelial nitric oxide synthase gene （T786C） Polymorphism and hypertensive disorder of pregnancy：a meta-analysis［J］．Chinese Journal of Perinatal Medicine，2017，20（4）：299-303．DOI：10.3760/cma.j.issn.1007-9408.2017.04.012.

［3］VANNEMREDDY P，NOTARIANNI C，YANAMANDRA K，et al．Is an endothelial nitric oxide synthase gene mutation a risk factor in the origin of intraventricular hemorrhage? ［J］．Neurosurg Focus，2010，28（1）：E11．DOI：10.3171/2009.10.FOCUS09143.

［4］POGGI C，GIUSTI B，GOZZINI E，et al．Genetic contributions to the development of complications in preterm newborns［J］．PLoS One，2015，10（7）：e0131741．DOI：10.1371/journal.pone.0131741.

［5］邵肖梅，葉鴻瑁，丘小汕.實用新生兒學［M］．北京：人民衛生出版社，2011：416-422，706-715，477-483.SHAO X M，YE H M，QIU X S.Practice of eonatology［M］．Beijing：People's Medical Publishing House，2011：416-422，706-715，477-483.

［6］中華醫學會眼科學分會眼底病學組.中國早產兒視網膜病變篩查指南（2014年）［J］．中華眼科雜志，2014，50（12）：933-935．DOI：10.3760/cma.j.issn.0412-4081.2014.12.017.

［7］茹喜芳，馮琪.新生兒呼吸窘迫綜合征的管理——歐洲共識指南2013版［J］．中國新生兒科雜志，2013，28（5）：356-358．DOI：10.3969/j.issn.1673-6710.2013.05.021.RU X F，FENG Q.The management of neonatal respiratory distress syndrome——European consensus guidelines 2013［J］．Chinese Journal of Neonatology，2013，28（5）：356-358．DOI：10.3969/j.issn.1673-6710.2013.05.021.

［8］FATINI C，SOFI F，GORI A M，et al．Endothelial nitric oxide synthase -786T＞C，but not 894G＞T and 4a4b polymorphism influences plasma homocysteine concentrations in persons with normal vitamin status［J］．Clin Chem，2005，51（7）：1159-1164．DOI：10.1373/clinchem.2005.048850.

［9］Variant：rs2070744.The 1000 Genomes Project Phase 3［EB/OL］．（2015-10-01）［2017-05-02］．http：//www.Ensembl.org./Homo_sapiens/Variation/Population?db=core；r=7：150992491-150993491；V=rs2070744；vdb=variation；vf=1492708.

［10］Variant：rs1799983.The 1000 Genomes Project Phase 3［EB/OL］．（2015-10-01）［2017-05-02］．http：//www.Ensembl.org./Homo_sapiens/Variation/Population?db=core；r=7：150998523-150999523；v=rs1799983；vdb=variation；vf=1244106.

［11］CAICEDO A，DE SMET D，VANDERHAEGEN J，et al．Impaired cerebral autoregulation using near-infrared spectroscopy and its relation to clinical outcomes in premature infants［J］．Adv Exp Med Biol，2011，701：233-239．DOI：10.1007/978-1-4419-7756-4_31.

［12］BATTON B，LI L，NEWMAN N S，et al．Early blood pressure，anti-hypotensive therapy and outcomes at 18 to 22 month corrected age in extremely preterm infants［J］．Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed，2016，101（3）：F201-206．DOI：10.1136/arch dischild-2015-308899.

［13］ALICIGUZEL Y，OZEN I，ASLAN M，et al．Activities of xanthine oxidoreductase and antioxidant enzymes in different tissues of diabetic rats［J］．J Lab Clin Med，2003，142（3）：172-177．DOI：10.1016/S0022-2143（03）00110-0.

［14］STEPANOVA E L，SKVARSKAIA E A.Role of polymorphism NO-synthase gene in the pathogenesis of multifactorial disease［J］．Lik Sprava，2014（5/6）：47-55.

［15］GIBSON C S，MACLENNAN A H，DEKKER G A，et al．Candidate genes and cerebral palsy：a population-based study［J］．Pediatrics，2008，122（5）：1079-1085．DOI：10.1542/peds.2007-3758.

［16］RUSAI K，VANNAY A，SZEBENI B，et al．Endothelial nitric oxide synthase gene T-786C and 27-bp repeat gene polymorphisms in retinopathy of prematurity［J］．Mol Vis，2008，14：286-290.

［17］YANAMANDRA K，NAPPER D，PRAMANIK A，et al．Endothelial nitric oxide synthase genotypes in the etiology of retinopathy of prematurity in premature infants［J］．Opthalmic Genet，2010，31（4）：173-177．DOI：10.3109/13816810.2010.497528.

［18］SZPECHT D，GADZINOWSKI J，SEREMAK-MROZIKIEWICZ A，et al．Role of endothelial nitric oxide synthase and endothelin-1 polymorphism genes with the pathogenesis of intraventricular hemorrhage in preterm infants［J］．Sci Rep，2017，7：42541．DOI：10.1038/srep42541.

［19］DEMIRCUBUK A G，COSKUN M Y，DEMIRYUREK S，et al．Endothelial NOS gene Glu298Asp polymorphism in preterm neonates with respiratory distress syndrome［J］．Pediatr Pulmonol，2013，48（10）：976-980．DOI：10.1002/ppul.22759.