龍眼肉不同提取物的神經保護作用及其機制

遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 116600

龍眼肉為無患子科植物龍眼DimocarpuslonganLour. 的假種皮，屬藥食同源類中藥，具有補益心脾，養血安神之功效；臨床用于氣血不足，健忘失眠等癥[1]。現代研究表明，龍眼肉具有改善記憶[2]、抗焦慮[3]、抗氧化[4-5]等多種作用，據報道，氧化應激很可能是記憶減退、焦慮證等的一個共同誘因[6-7]。PC12 細胞來源于大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤，因其具有許多神經元特性，被廣泛用于老年癡呆、焦慮證等神經系統疾病的體外研究[8]。基于龍眼肉的上述作用，作者推測，龍眼肉很可能具有神經細胞保護作用；課題組前期研究也表明，龍眼肉提取物能夠促進PC12細胞增殖并抑制其凋亡[9]，但對不同提取物的神經保護作用及其機制的比較研究前期未做報道。本研究通過比較龍眼肉不同提取物對細胞增殖、凋亡及氧化應激的影響，探討龍眼肉不同提取物的神經保護作用，為系統研究龍眼肉神經保護作用的物質基礎及機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 龍眼肉，安徽益生源中藥飲片科技有限公司(批號160301)；高分化PC12細胞，遼寧中醫藥大學藥理實驗室提供；DMEM高糖培養基(批號8116244)，Gibco；胰蛋白酶(批號GP3108)、青鏈霉素雙抗溶液(批號GA3502)、Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒(批號113688)，Genview；胎牛血清(批號：20160629)，四季青；MTT(批號M8180)，北京Solaibio；Aβ25-35(批號095M4774V)，Sigma；SOD(批號DZE30169)、MDA(批號DZE30157) Elisa試劑盒，南京建成；NU-4750型二氧化碳培養箱，Nuaire；RE-52 旋轉蒸發儀，上海亞榮；NIB-100F型倒置熒光顯微鏡，寧波永新；MR-96A型酶標儀，深圳邁瑞；NoVocyte 451141112066流式細胞儀，艾森生物。

1.2 方法

1.2.1 龍眼肉不同提取物的制備 龍眼肉，用1∶12(m∶v)的去離子水微沸提取1 h，提取3次，合并濾液，按極性大小，依次采用乙酸乙酯和正丁醇萃取，收集合并各次濾液，分別得到龍眼肉的乙酸乙酯、正丁醇和水提取物，60 ℃減壓濃縮，4 ℃密封保存。

1.2.2 MTT實驗及SOD、MDA水平測定 對數生長期的PC12細胞以105/mL密度，接種于96孔板，37 ℃、5%CO2培養箱中培養12 h后，隨機分為正常組、模型組和龍眼肉提取物高低劑量組及石杉堿甲組，于加入Aβ前2 h加入；模型組與給藥組同步加入Aβ25μM；正常組常規培養。加入Aβ24 h后，吸出各組細胞上清液，采用Elisa試劑盒檢測SOD活性及MDA含量；細胞中加入5 mg/mL MTT，繼續培養4～6 h，加入100μL DMSO于酶標儀490 nm處測定各孔吸光度(A)值，計算細胞存活率。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 PC12細胞接種于6 cm培養皿中，隨機分為正常組，模型組和龍眼肉提取物組。除正常組常規培養外，其余各組采用200 μM H2O2處理細胞8 h，給藥組加入H2O2前先加受試藥物預處理2 h。經H2O2處理12 h后，流式細胞儀檢測細胞凋亡。每組3個復孔。

1.2.4 統計學分析 采用SPSS 13.0統計軟件進行統計。組間比較采用單因素方差分析和t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 龍眼肉不同提取物對細胞增殖的影響 MTT法檢測結果(圖1)表明，細胞存活率模型組較正常組降低(P<0.05)，龍眼肉水提取物0.5、1.0 mg/mL和正丁醇提取物1.0 mg/mL組較模型組提高(P<0.01)；正丁醇提取物0.5 mg/mL、乙酸乙酯提取物和陽性對照石杉堿甲(2 μM)，實驗濃度范圍內未見神經保護作用(P>0.05)。結果提示，實驗濃度范圍內，龍眼肉水提取物促進細胞增殖作用最明顯。

2.2 龍眼肉不同提取物對SOD、MDA水平的影響 圖2A結果表明，SOD活力，模型組較正常組SOD降低(P<0.05)；龍眼肉水和正丁醇提取物組較模型組提高(P<0.05，P<0.01)；乙酸乙酯提取物組與模型組比較無差異但有升高趨勢。圖2B結果表明，MDA含量模型組較正常組增加但無顯著差異；龍眼肉不同提取物對MDA含量亦無明顯影響。結果提示，實驗濃度下，龍眼肉水提取物抗氧化能力最強。

水、正、乙分別代表水、正丁醇和乙酸乙酯提取物；0.5、1.0代表給藥濃度0.5、1.0 mg/mL；石杉代表石杉堿甲 2 μM。

2.3 龍眼肉不同提取物對細胞凋亡的影響

由圖3可見，龍眼肉不同提取物均可使受損細胞活細胞數提高(P<0.01，圖3B)、早期凋亡細胞減少(P<0.01，P<0.05，圖3C)；對晚期凋亡及細胞壞死，僅乙酸乙酯部位有明顯作用。

3 討論

高分化PC12細胞因具有神經內分泌細胞的一般特征，被廣泛應用于神經系統疾病研究。Aβ和H2O2均具有細胞毒性，可誘導細胞氧化應激損傷。因Aβ沉積是阿爾茨海默病(AD)的主要病理特征之一，氧化應激又是導致AD的一個重要誘因，故Aβ和H2O2常被用于構建體外AD細胞模型。作者前期采用H2O2誘導PC12細胞損傷，用龍眼肉不同提取物進行干預，結果表明，龍眼肉水、正丁醇及乙酸乙酯提取物對細胞存活均有一定的保護作用，實驗濃度范圍內，以乙酸乙酯提取物促進細胞增殖作用最明顯，并且其對H2O2誘導的細胞凋亡有一定抑制作用[9]。但是，不同提取物對Aβ誘導的體外AD模型是否有保護作用以及不同提取物對H2O2誘導的細胞凋亡的比較研究前期均未報道。本研究采用Aβ和H2O2誘導建立PC12細胞損傷模型，并探討龍眼肉不同部位的神經保護作用。綜合本實驗結果并聯合前期實驗結果，作者推測，龍眼肉不同極性部位均有神經保護作用，但作用機制不完全相同：水和正丁醇提取物主要是提高細胞抗氧化能力，抑制早期細胞凋亡；乙酸乙酯提取物主要是抑制細胞各期凋亡及壞死。

[1]中國藥典委員會.中國藥典[M].北京:中國醫藥科技出版社, 2015.

[2]白亞娟, 劉磊, 張瑞芬, 等. 龍眼果肉提取物改善東莨菪堿誘導小鼠學習記憶功能[J]. 中國農業科學, 2016, 49(21): 4203-4213.

[3]盛康美，王宏潔. 龍眼肉的化學成分與藥理作用研究進展[J].中國實驗方劑學雜志,2010,16(5):236-238.

[4]林耀盛, 張名位, 張瑞芬, 等. 不同品種龍眼果肉酚類物質的抗氧化活性比較[J]. 食品科學技術學報, 2016, 34(3): 20-30.

[5]C Guo,J Yang,J Wei,et al. Antioxidant activities of peel, pulp and seed fractions of common fruits as determined by FRAP assay[J]. Nutrition Research,2003, 23: 1719-1726.

[6]Keddis M T, Khanna S, Noheria A, et al. Clostridium difficile, Infection in Patients With Chronic Kidney Disease[J]. Mayo Clinic Proceedings, 2012, 87(11):1046-1053.

[7]李琨, 裴卉, 曹宇,等. 參麻益智方對血管性癡呆模型大鼠海馬形態及氧化應激的影響[J]. 北京中醫藥, 2017(5):397-400.

[8]王欣, 劉持年, 呂征,等. 酸棗仁湯含藥血清對皮質酮損傷的PC12細胞[Ca2+]i、CaM的影響[J]. 山東中醫藥大學學報, 2009(1):68-70

[9]李紅艷, 倪雪嬌, 陳曉霞, 等. 龍眼提取物對H2O2致PC12細胞損傷的保護作用[J].中國民族民間醫藥, 2018, 27(2): 48-51.