腎茶總黃酮的含量測定

西雙版納州食品藥品檢驗所，云南 景洪 666100

腎茶Clerodendranthusspicatus(Thunb.)C.Y.Wu又名貓須草，傣名“雅糯秒”，全草入藥，為傣醫常用藥，有清火解毒，利尿排石，涼血止血之功[1]。傣藥是四大民族醫藥之一，腎茶是傣醫臨床常用、療效確切、具有解毒特色的常用品種，已開發出一些傣藥產品如腎茶袋泡劑，取得了良好的經濟效益和社會效益。腎茶含有橙黃酮、3′- 羥基-5,6,7,4′-四甲氧基黃酮、α-香樹素、、熊果酸、6-甲氧基芫花素、5-羥基- 7 ,3′,4′-三甲氧基黃酮、鼠尾草素、5- 羥基-6 ,7,3 ,4′-四甲氧基黃酮、澤蘭黃素、3′- 羥基- 5 ,7,8,4′- 四甲氧基黃酮、異橙黃酮、黃芪苷、異槲皮素、原兒茶醛、原兒茶酸、3,4 -二羥基苯酰甲醇 、迷迭香酸、迷迭香酸乙酯、秦皮乙素等化合物[2-5]，其中含有的甲氧基黃酮主要是橙黃酮、半齒澤蘭素、半齒澤蘭素-5-甲醚(結構式見圖)。文獻報道[6-15]甲氧基黃酮類具有明顯的抗氧化、抗腫瘤、抗炎、免疫調節及保護心血管作用，被譽為“天然抗氧化劑”。腎茶的標準收載于《湖南省中藥材標準》(2009年版)、《廣西壯族自治區壯藥質量標準》(第二卷)(DYB45-GXZYCO111-2011)，《云南省中藥飲片標準》2005年版第一冊。目前，未見對腎茶飲片總黃酮含量測定的報道[16]，按《中國藥典》2015年版四部通則[17]建立腎茶總黃酮含量測定方法，為腎茶質量標準的提高及后期產品研發奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UV-2550紫外可見光分光光度儀(島津)；101-EBS電熱鼓風干燥箱(北京市永光明醫療儀器廠)； DZKW-D-6 DIAN水浴鍋(北京市永光明醫療儀器有限公司)； BL310天平(德國賽多利斯集團)；AE200電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。

1.2 材料 蘆丁對照品(批號：100080-201610，中國食品藥品檢定研究院)。無水乙醇(分析純)、氫氧化鈉(優級純)、亞硝酸鈉(分析純)、硝酸鋁(分析純)均為天津市風船化學試劑科技有限公司生產，水為蒸餾水。不同產地的22批藥材分別采自云南景洪市、云南勐海縣、云南勐臘縣、云南普洱市、海南、云南瑞麗、云南元江、福建廈門、廣西南寧。由西雙版納州食品藥品檢驗所彭霞主任藥師鑒定為唇形科植物腎茶Clerodendranthusspicatus(Thunberg) C. Y. Wu ex H. W. Li 的干燥地上部分。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品25 mg，置50 mL量瓶中，加乙醇適量，超聲處理使溶解，放冷，加乙醇至刻度，搖勻。精密量取20 mL，置50 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得(每1 mL中含蘆丁0.2 mg )。

2.2 標準曲線的制備 精密量取對照品溶l、2、3、4、5、6 mL，分別置25 mL量瓶中，各加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6分鐘，加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應試劑為空白，按照紫外-可見分光光度法(通則0401)，在500 nm的波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

2.3 測定法 取本品粉末約0.12 g，置具塞三角瓶中，精密稱定，加入50%乙醇溶液100 mL，精密稱定，置85℃水浴上回流1 h，放冷，精密稱定，用50%乙醇溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液10 mL，置25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，照標準曲線制備項下的方法，自“加水至6 mL”起依法測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中蘆丁的重量。按干燥品計算，含總黃酮以蘆丁(C27H30O16) 計的量。

2.4 吸收光譜的測定、光譜一致性檢測 精密吸取蘆丁對照品溶液、供試品溶液各4 mL，分別置25 mL量瓶中，照分光光度法，在200～750 nm波長范圍內測定吸收光譜，結果蘆丁對照品與供試品光譜吸收圖譜基本一致，在500 nm波長處有最大吸收。參照腎茶膠囊中總黃酮的含量測定[18]及《中國藥典》(2015年版一部)[19]收載 “山楂葉”中總黃酮的含量測定方法中蘆丁的測定波長為500 nm，因此選取檢測波長為500 nm。

2.5 線性關系考察 精密吸取蘆丁對照品溶液0.25、0.50、0.75、1、2、3、4、5、6 mL(相當于蘆丁1.98090、3.96180、5.94270、7.92360、15.84719、23.77079、31.69439、39.61798、47.54158 μg/mL)，按上述測定法測定吸收度，以吸收度為縱坐標，濃度為橫坐標 ，繪制標準曲線，計算得回歸方程：Y= 0.01229X-0.00251，r2=0.9998，試驗結果表明蘆丁在2～48μg/mL范圍內的線性關系良好。

2.6 精密度試驗 取同一批號樣品6份(產地：西雙版納勐臘縣勐滿農場，批號：1612312)，按供試品測定方法測定，總黃酮平均含量為17.3%，RSD為0.78%。

2.7 重復性試驗 精密量取2.1項下對照品溶液(31.69439μg/mL)，按“2.3”項下方法操作，依次測定7次，以吸收度值計算RSD為0.060%，結果符合要求。

2.8 加樣回收率試驗 根據《中國藥典》2015版四部(通則9101)，藥品質量標準分析方法驗證指導原則中準確度相關規定，設計同一濃度，9份供試品溶液照2.3方法進行測定，用9個測定結果進行評價。該分析方法的回收率為95.13%～100.01%，且RSD為1.58%，結果符合要求。表明該法準確可靠，可用于腎茶總黃酮含量測定。

2.9 樣品測定 取不同產地22批腎茶，按照上述方法制備供試品溶液，分別測定22批樣品，按2.2確定的工作曲線，以干燥品計算總黃酮含量，結果見表1。由表2可得，F=5030.293>F0.01(21,22)=2.74，即說明不同產地腎茶中總黃酮的含量差異極顯著。

2.10 樣品不同部位測定 按照上述方法，分別測定了5批樣品的莖和葉總黃酮的含量，按干燥品計算，結果見表3。由表4可得，F=28390.505>F0.01(9,10)=4.95，即說明不同地區腎茶不同部位總黃酮的含量差異極顯著。

表1 不同產地腎茶總黃酮的含量 (n=2)

表2 不同產地腎茶總黃酮的含量方差分析結果

注：“*”表示差異達到F0.05顯著水平，“**”表示差異達到F0.01極顯著水平。

表3 腎茶不同部位總黃酮的含量 (n=2)

表4 腎茶不同部位總黃酮的含量方差分析結果

注：“*”表示差異達到F0.05顯著水平，“**”表示差異達到F0.01極顯著水平。

3 討論

3.1 試驗條件的考察 試驗采用分光光度法以蘆丁為對照品，以相應的試劑為空白，分別考察溶劑：甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇；提取方式：回流提取(提取時間分別為60 min、120 min、180 min；回流溫度分別為75 ℃、85 ℃、95 ℃)；超聲處理(超聲時間分別為30 min、45 min、60 min)、振搖提取(振搖時間為120 min溫度為65 ℃)、取樣量(0.12 g、0.25 g、0.50 g)制備的供試品溶液，在500 nm波長處測定吸光度，計算總黃酮的含量。結果表明，取樣量為0.12 g，50%乙醇為溶劑85 ℃回流提取，腎茶中總黃酮的溶出量最大，回流時間60 min、120 min、180 min腎茶中總黃酮的溶出量變化不大，選擇取樣量為0.12 g，以50%乙醇為溶劑，提取溫度為85 ℃回流60 min制備供試品溶液。

3.2 單因素方差分析 目的是通過分析各樣本之間的差異，來檢驗各樣本總體效應之間的差異，從而確定該因素對試驗結果是否有顯著性影響。由表2可得，F=5030.293>F0.01(21,22)=2.74，即說明不同產地腎茶中總黃酮的含量差異極顯著。由表4可得，F=28390.505>F0.01(9,10)=4.95，即說明不同地區腎茶不同部位總黃酮的含量差異極顯著。

腎茶含有的甲氧基黃酮類，藥理研究表明[6-15]具有明顯的抗氧化、抗腫瘤、抗炎、免疫調節及保護心血管作用，腎茶為西雙版納傣族自治州的傣族常用藥物，平時代茶飲，用于治療腎炎、腎結石等疾病，深入研究其質量控制方法顯得尤為重要。本實驗結果顯示不同產地腎茶總黃酮含量差異極顯著，不同部位(莖、葉)總黃酮含量差異極顯著。本研究建立了分光光度法法測定腎茶中總黃酮的含量，此方法簡便、快速、準確，經方法學驗證，可作為檢驗腎茶中總黃酮的含量的一種手段，為腎茶藥材的進一步研究提供方法依據。

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