棉籽油脂肪酸甲酯化的方法及其脂肪酸含量分析

王 川,韓珍珍,文 鳳,李艷軍,孫 杰,尤春源,劉 峰,*

(1.石河子大學農學院,新疆石河子 832000; 2.石河子農業科學院棉花所,新疆石河子 832000)

棉花既是最重要的纖維作物,又是重要的油料作物。棉花的棉籽中含有25%～35%的棉籽油[1]。常用于煎炸各類食品、做各種食用調和油的原料等[2]。2014年我國棉籽油的產量為139.6萬t,棉籽油消費量達139.4萬t,是我國第五大食用植物油(國家糧油信息中心)。作為食用植物油的重要來源,棉籽油的脂肪酸組分和營養功能越來越受到人們的重視[3]。因飽和脂肪酸具有較低的凝固點,所以在植物油脂中,如果飽和脂肪酸組分含量過高,會使得植物油脂在較低溫度下發生凝絮、渾濁、半凝固甚至凝固。同時飽和脂肪酸可能還會增加人體心血管疾病的發病幾率[4]。而多不飽和脂肪酸的亞油酸與亞麻酸對人體健康是有益的,但其易氧化不穩定,在一般貯藏條件下易發生自動氧化酸敗產生異味;在加熱過程中易氧化形成自由基加速細胞老化,還易通過氫化作用生成反式脂肪酸,反而增加人體的心血管疾病發病率[5]。因此,對棉籽油的脂肪酸組分進行深入分析,不僅對飲食營養健康有影響,還對其加工與儲藏有重要意義。

新疆是我國最主要的棉花產區,“新陸早39”與“新陸早50”是新疆本地有代表性栽培品種。新疆棉花的主副產品—棉籽加工后的棉籽油市場容量越來越大。油脂樣品中脂肪酸組分相對含量的測定基本是通過氣相色譜GC-MS來進行。對油脂進行GC-MS分析前,必須進行脂肪酸組分的甲酯化,甲酯化的效率也直接影響著脂肪酸的分析[6]。目前,植物油脂肪酸甲酯化常用的三種方法分別為KOH-甲醇法、H2SO4-甲醇和BF3-甲醇法。為了快速分析棉籽脂肪酸組分,本研究以 “新陸早39”與“新陸早50”的棉籽為材料,利用Soxtherm索式全自動抽提儀對其油脂進行提取,通過對三種常用甲酯化方法比較分析,并通過制作脂肪酸標準曲線,利用GC-MS外標法對兩個品種棉籽的脂肪酸組分進行準確定性定量;為棉籽油的種質資源評價利用和綜合加工提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新陸早39號和新陸早50號 石河子大學棉花所提供;37種脂肪酸甲酯混標 Sigma-Aldrich公司;正己烷(色譜純) Merck公司;石油醚(沸程30～60 ℃)、甲醇(分析純)、無水硫酸鈉(分析純)、氫氧化鉀(分析純)、硫酸(分析純)、14% BF3-甲醇溶(分析純) 國藥集團化學試劑有限公司。

GC-MSQP2020氣象色譜-質譜聯用儀 島津公司;Soxtherm索式全自動抽提儀 德國Gerhardt公司;SY21-K型電熱恒溫水浴鍋 北京長風儀器儀表公司;DHG-940AS型電熱恒溫鼓風干燥箱 寧波東南儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 棉籽中總油脂的提取 參考王美霞等的方法[7],略有改進。將棉籽去殼后,用液氮研磨粉碎,粉碎過40目篩得到棉仁粉,冷凍干燥后準確稱量0.5 g干粉樣品,用定量濾紙包好,將濾紙包稱重后放入提取杯中。加入兩顆沸石,然后加入130 mL石油醚,然后采用Soxtherm索式全自動抽提儀進行提取棉仁中油脂。提取結束后將濾紙包取出,放入55 ℃烘箱中烘干至恒重。根據濾紙包前后重量差,計算油脂提取得率。根據以下公式計算。

式中:m2為紙包提取前的質量,mg;m1為紙包提取后的質量,mg;m0棉仁粉的質量,mg。

1.2.2 棉籽中脂肪酸組分的甲酯化

1.2.2.1 H2SO4-甲醇法 參照楊藝婷等的方法[8],略有改進。將提取杯中的脂肪酸(約100 mg)加入5 mL正己烷,用塑料薄膜將提取杯封口,放置5 min,待瓶中油脂充分溶解于正己烷后,轉移至10 mL血清瓶中。向血清瓶中加入1% H2SO4-甲醇5 mL混勻,置于60 ℃水浴鍋水浴30 min,取出冷卻至室溫之后加入少許無水硫酸鈉,靜置30 min取上清液500 μL,作為上機分析試樣。

1.2.2.2 BF3-甲醇法 參照黃錚等方法[9],略有改進。將提取杯中的脂肪酸加入5 mL正己烷,用塑料薄膜將提取杯封口,放置5 min,待脂肪酸充分溶解之后向血清瓶中加入14% BF3-甲醇5 mL混勻,置于60 ℃水浴鍋水浴15 min,取出冷卻至室溫后加入少許無水硫酸鈉,靜置30 min取上清液500 μL,作為上機分析試樣。

1.2.2.3 KOH-甲醇法 參照回瑞華等的方法[10],略有改進。將提取杯中的脂肪酸加入5 mL正己烷,用塑料薄膜將提取杯封口,放置5 min,向血清瓶中加入0.4 mol/L KOH-甲醇5 mL混勻,置于恒溫搖床搖晃30 min,取出之后加入少許無水硫酸鈉,靜置30 min取上清液500 μL,作為上機分析試樣。

1.2.3 GC-MS分析 GC-MS條件:HP-88石英毛細管柱(100.0 m×0.2 mm×0.20 μm);升溫程序40.0 ℃保持2 min,以4 ℃/min升至240 ℃,保持15 min;柱箱溫度40 ℃;進樣口溫度250 ℃;進樣方式:分流,分流比10∶1;載氣:氦氣(He),初始壓力500～900;流量控制方式:線速度;壓力:176.6 kPa;線速度20.0 cm/s;吹掃流量3.0 mL/min;進樣量1 μL;電子電離源;離子源溫度200 ℃;接口溫度250 ℃;監測方式為全掃描;質量掃描范圍m/z 40～500;溶劑延遲時間13 min。

1.2.4 定量分析 把已知濃度的37種脂肪酸甲酯混標(Sigma-Aldrich)用正己烷(色譜純)分別稀釋成2、5、10、20、40倍。分別記作A2、B5、C10、D20、E40。直接GC-MS上機分析,各不同濃度標樣GC-MS重復三次。根據稀釋的五個不同濃度的標樣制作標準曲線,保存此方法。使用外標法分析樣品中脂肪酸甲酯的含量,通過同種標準曲線分析的方法對“新陸早39”與“新陸早50”的棉籽的脂肪酸組分進行分析,根據定量離子的響應值和建立的標準曲線進行絕對定量。

1.3 數據處理

通過NIST普庫對脂肪酸組分進行定性分析,通過外標法進行定量分析,根據定量結果計算各脂肪酸組分的相對百分含量。實驗數據均重復3次,取平均值,采用SPSS方法進行統計分析,EXCEL作圖。

2 結果與分析

2.1 37種脂肪酸甲酯混合標準樣品的GC-MS定性分析

使用GC-MS/SCAN的分析方式,得到37種脂肪酸標樣的總離子流圖(圖1),以及37種脂肪酸甲酯的特征離子片段和相對保留時間(表1)。結果表明脂肪酸甲酯出峰時間根據碳原子的數目由少到多的順序進行出峰。進而可根據37種脂肪酸甲酯的相對出峰時間,對“新陸早39”與“新陸早50”的棉籽中各脂肪酸組分進行定性分析;當相似度大于95%時,對脂肪酸組分進行確認。

表1 37種脂肪酸甲酯混合標準樣品的GC-MS定性結果 Table 1 GC-MS qualitative analysis of 37 fatty acid methyl ester mixed standards

圖1 37種脂肪酸甲酯混合標準樣品總離子流圖Fig.1 Total ion current of a standard mixture of 37-component fatty acid methyl esters by GC-MS

2.2 三種不同甲酯化方法對GC-MS分析的影響

通過三種不同甲酯化方法對GC-MS影響的分析,結果表明,H2SO4-甲醇法與14% BF3-甲醇法在“新陸早39”中檢測到6種脂肪酸組分:豆蔻酸甲酯(C14∶0),棕櫚酸甲酯(C16∶0),硬脂酸甲酯(C18∶0),油酸甲酯(C18∶1),反式異油酸甲酯(C18∶1),亞油酸甲酯等(C18∶2),在“新陸早50”中也只檢測到六種脂肪酸組分(與“新陸早39”檢測結果相同)。采用KOH-甲醇法進行甲酯化,GC-MS檢測到了更多的脂肪酸組分,比如棉籽中一些含量很低(百分含量低于0.5%)的脂肪酸組分,如花生酸甲酯(C20∶0)和山崳酸甲酯(C22∶0)等(圖2)。

圖2 三種不同甲酯化條件下的 “新陸早39”棉籽的脂肪酸組分GC-MS分析Fig.2 Fatty acid composition in cottonseed of “Xinluzao 39” methylated by three kinds of catalysts determined by GC-MS

采用KOH-甲醇法,在“新陸早39號”棉籽中檢測到10種脂肪酸組分:豆蔻酸甲酯(C14∶0),棕櫚酸甲酯(C16∶0),棕櫚油酸甲酯(C16∶1),硬脂酸甲酯(C18∶0),油酸甲酯(C18∶1),順式異油酸甲酯(C18∶1),亞油酸甲酯(C18∶2),花生酸甲酯(C20∶0),亞麻酸甲酯(C18∶3),山崳酸甲酯(C22∶0)。與“新陸早39號”類似,在“新陸早50號”中除了含量極低的棕櫚油酸外,其他9種脂肪酸組分均檢測到。以上結果表明,相對于H2SO4-甲醇法及14% BF3-甲醇法,采用KOH-甲醇法對棉籽提取的油脂進行甲酯化,能更有效檢測到棉籽的脂肪酸組分。

2.3 棉籽脂肪酸組分定量分析

根據定量分析的方法,進行標準曲線的制作。圖3所示為棉籽中9種脂肪酸甲酯的校正曲線。校正曲線的縱坐標是峰面積,橫坐標是濃度。在進行定量分析時采用與校正曲線相同條件,進行等量分析,在色譜圖上就可以得出峰高或峰面積,進而可以計算出濃度。本研究結果顯示,校正曲線相關系數高,線性結果良好,可以準確定量棉籽脂肪酸組分。我們的研究結果表明,發育成熟的棉籽中,其油脂的脂肪酸組分主要是由飽和脂肪酸的棕櫚酸(C16∶0),和單不飽和脂肪酸的油酸(C18∶1)、以及多不飽和脂肪酸的亞油酸(C18∶2)等組成,這也與前人的研究相一致[11-12]。定量分析結果表明,“新陸早39”與“新陸早50”的每克棉仁油脂含量分別為245.02 mg與256.04 mg,即棉仁中的油脂百分含量分別為24.5%、25.6%。棉籽中飽和脂肪酸組分較高的為棕櫚酸和硬脂酸,其它飽和脂肪酸組分含量相對較低。飽和脂肪酸含量較高的棕櫚酸在“新陸早39”與“新陸早50”的含量分別為26.55%和23.24%?！靶玛懺?9”與“新陸早50”的棉籽油脂肪酸中不飽和脂肪酸包括棕櫚油酸、油酸、反式異油酸、亞油酸、亞麻酸等;其中單不飽和的脂肪酸組分油酸的含量也相對較高,在這兩個品種中分別達10.12%和8.28%;其含量要略低于其他已報道棉籽中油酸的含量[13],在“新陸早39”的棉籽中還檢測出棕櫚油酸,其含量很低,在組分中的相對百分含量中很低,僅為0.07%(表2)。多不飽和脂肪酸以亞油酸為主,在這兩個品種中每克棉仁中含量分別達到147.29 mg與163.2 mg;相對百分含量分別為60.12%和60.83%,遠遠超過其他脂肪酸組分,其含量高于其他已報導的棉籽亞油酸含量[14]。多不飽和脂肪酸在植物體內涉及許多生理反應,多不飽和脂肪酸參與細胞膜的組成,可調節細胞構型、動態平衡、膜的滲透性等,同時還具有一些表達調控的作用,參與脂質代謝、細胞識別、免疫反應和寒冷的適應性等生理過程[15-16]。多不飽和脂肪酸組分與低溫、鹽脅迫存在一定關聯;同時對植物耐逆境有一定影響。積累了較高比例的亞油酸可以增強對環境的適應性,新疆相對于其他地區溫度相對較低,鹽堿化相對嚴重,所以積累了相對較高的亞油酸含量,可以增強植物耐逆性。此外,油脂中不飽和脂肪酸含量多,碘價也越高,油脂就容易氧化。在儲藏過程中,由于油脂變質差生醛、酮、酸等物質發生苦味和不良氣味。因此,對植物油的貯藏與加工是不利的。

表2 “新陸早39”與“新陸早50”棉籽中的脂肪酸組分Table 2 The fatty acid composition of seed oil of “Xinluzao39” and “Xinluzao39” cotton varieties

圖3 脂肪酸甲酯組分GC-MS定量標準曲線及相關系數Fig.3 The quantitative standard curve and correlation coefficient of fatty acid methyl ester composition determinated by GC-MS注:C14∶0,豆蔻酸甲酯;C16∶0,棕櫚酸甲酯;C16∶1,棕櫚油酸甲酯;C18∶0,硬脂酸甲酯;C18∶1,油酸甲酯; C18∶1,反式異油酸甲酯;C18∶2,亞油酸甲酯;C18∶3,亞麻酸甲酯;C22∶0,山崳酸甲酯。

3 結論

新疆的棉花產量占全國的60%,是重要的棉籽油來源地區。本研究通過對新疆本地兩個棉花品種“新陸早39”與“新陸早50”的棉籽進行總油脂提取,分別采用三種常用的脂肪酸甲酯化方法:KOH-甲醇法,H2SO4-甲醇,14% BF3-甲醇法進行甲酯化后,GC-MS上機分析;并通過外標法進行定量。結果表明采用KOH-甲醇法可以檢測到棉籽更多的脂肪酸,且其操作最為方便。而H2SO4-甲醇法與14% BF3-甲醇法操作不便,需要進行水浴加熱,且BF3具有較強的毒性。所以KOH-甲醇法適用于棉籽脂肪酸的甲酯化,其相對優于其他兩種方法。GC-MS定量分析也表明,棉籽油脂肪酸相對穩定的單不飽和脂肪酸的油酸含量約占棉籽油的8.28%～10.12%左右,而棉籽油中多不飽和的亞油酸含量高達60%左右。棉籽油作為食用植物油重要來源,本研究為棉籽脂肪酸快速測定及脂肪酸組分分析提供了數據和理論指導;對棉籽油營養評價、儲藏與加工等都有一定參考意義。

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