巨噬細胞遷移抑制因子及炎癥因子在晝夜節律改變小鼠心臟缺血再灌注損傷中的作用

王璐萍 陶潞淵 黃凱宇 宋喜發 張素勤 殷日鵬

研究發現，倒班工作人群的自身晝夜節律受到嚴重影響[1-3]，而維持正常的晝夜節律是保證心血管系統正常運行的基礎[4-7]。Fujino等[8]報道，在日本工廠，倒班人群和固定上白班的人群相比其發生缺血性心臟病的風險顯著增加。另有動物實驗證實，短時間影響心肌梗死后小鼠晝夜節律，其遠期心臟結構將發生改變，導致遠期心功能惡化[9]。目前已有研究表明，晝夜節律影響缺血再灌注損傷[10]，但相關的機制研究不多。因此有必要對晝夜節律紊亂和缺血再灌注損傷之間的機制進行進一步探索。目前研究認為，炎癥因子是參與心肌缺血再灌注損傷的一個重要因素[11]，局部炎癥反應在缺血再灌注損傷中發揮重要作用，被認為是缺血性心肌病不斷進展的罪魁禍首。同時已有研究顯示，巨噬細胞遷移抑制因子（MIF）可以有效調控缺血性心肌病心肌炎癥細胞因子的釋放[12]。

我們的前期研究已證實，4周的黑暗環境暴露能影響小鼠的晝夜節律，并且使小鼠心肌組織MIF的表達下降，因此我們設計此實驗，通過檢測比較晝夜節律紊亂小鼠及正常節律小鼠缺血再灌注損傷前后心肌MIF、炎癥因子表達和心功能等，進一步研究MIF及炎癥因子在晝夜節律改變小鼠心臟缺血再灌注損傷中的作用，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 8周齡大的C57BL/6雄性小鼠36只，體質量20～23g（購自上海史萊克實驗動物中心），均先在12h光照/黑暗周期環境中[溫度（22 ±1°C），光照上午 6：00開始，200～220lux光照強度]飼養2周。本研究所有實驗過程均嚴格遵守中國實驗動物福利法并經溫州醫科大學實驗動物使用倫理委員會批準同意。

1.2 儀器和試劑 超聲儀（ACUSON Sequoia 512，德國西門子公司），動物心電血壓記錄儀（美國Labchat公司），MIF單克隆抗體（英國Abcam公司），IL-6（美國RD公司），TNF-α、IL-8單克隆抗體（英國Abcam公司），辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 動物分組 將36只小鼠在12h光照/黑暗周期環境中飼養2周后稱重，按體重大小編號，通過隨機數字表隨機分為4組，每組9只。其中兩組繼續飼養在12h光照/黑暗周期環境中（正常節律組），另兩組飼養在24h持續黑暗的環境中（節律紊亂組），每周清理鼠籠1次，正常節律組小鼠白天清理，節律紊亂組小鼠在微弱紅光（1～2lux）下清理，持續4周時間。正常節律組飼養4周后一組行缺血再灌注處理，設為Normal缺血再灌注組，另一組直接行MIF蛋白、炎癥因子、心功能等檢測，設為為Normal組。節律紊亂組飼養4周后一組也行缺血再灌注處理，設為Disrupted缺血再灌注組，另一組直接行MIF蛋白、炎癥因子、心功能等檢測，設為Disrupted組。

1.3.2 心臟缺血再灌注 Normal缺血再灌注組及Disrupted缺血再灌注組小鼠均用異氟烷吸入麻醉后，行氣管插管，用小鼠呼吸機（Harvard)進行機械通氣，用加熱板維持小鼠體溫37°C，開胸，在左心耳下方2mm處用7-0尼龍線結扎前降支，結扎30min后松開結扎線，逐層關閉胸腔，移除小動物呼吸機，置于電熱毯保溫，待小鼠麻醉蘇醒后繼續飼養至原環境中3d。

1.3.3 心臟超聲檢查 Normal組及Disrupted組小鼠飼養4周后行心超檢查，Normal缺血再灌注組及Disrupted缺血再灌注組小鼠缺血再灌注處理后繼續飼養3d再行心超檢查。在2%異氟烷的吸入麻醉下行經胸心臟超聲檢查，測左心室舒張末內徑（Left Ventricle End Diastolic diameter，LVEDd）、左心室收縮末內徑（Left Ventricle End Systolic diameter，LVESd）、左心室射血分數（1eft ventricle ejective fraction，LVEF）、左心室短軸縮短率（left ventricular fraction shortening，LVFS）。所有數據由1位不了解分組且經驗豐富的技術人員測量至少3個連續的心臟周期。

1.3.4 HE染色 各組小鼠在超聲檢查后水合氯醛鈉（100mg/kg）腹腔內注射麻醉,經夾捏后爪判斷小鼠處于麻醉狀態后行頸椎脫臼法處死，取部分心肌組織固定、脫水、石蠟包埋、切片，行HE染色壓片，顯微鏡下觀察心臟病理形態以及炎癥細胞分布情況。

1.3.5 Western blot法檢測 各組取心肌組織各約50mg置于裂解緩沖液中勻漿，裂解心肌組織獲取蛋白后，用二喹啉甲酸（BCA）比色法測定蛋白濃度。加入蛋白上樣緩沖液，煮沸變性，十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠（SDS－PAGE）電泳，轉膜，脫脂奶粉封閉 2～3h，加入一抗 4℃孵育過夜（至少16h），Tris鹽酸緩沖液（TBST）洗滌5次，再分別加入二抗稀釋液中室溫孵育2h，將二抗孵育結束的PVDF膜取出，TBST洗滌5次，增強化學發光法（ECL）發光，曝光儀器中顯影，采用AlhaimagerTM2200圖像分析系統進行處理，Quantity one 4.0軟件進行分析,測定每一個目的條帶及內參蛋白（GAPDH）的吸光度值，并分別以MIF、IL-6、TNF-α、IL-8的光密度值與其對應的GAPDH光密度值之比表示其蛋白的表達水平。

1.4 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件，正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 飼養4周后Normal組和Disrupted組小鼠體重心超檢查結果和心肌MIF表達變化 經過4周持續黑暗環境暴露后，蛋白印跡顯示∶Disrupted組小鼠心肌MIF蛋白的表達較 Normal組小鼠顯著降低（a、b）；Disrupted組小鼠和Normal組小鼠體重（c）無差異；Disrupted組小鼠和Normal組小鼠心超檢查結果無統計學差異（d-h）。見圖1。

圖1 飼養4周后Normal組和Disrupted組小鼠體重心功能和心肌MIF表達變化（與Normal組相比，*P＜0.05）

2.2 飼養4周后4組小鼠心臟炎癥因子表達的比較 Disrupted 組小鼠心肌 IL-6、TNF-α、IL-8 的表達高于 Normal組小鼠；Disrupted缺血再灌注組心肌IL-6、TNF-α、IL-8的表達顯著高于Normal缺血再灌注組，均P＜0.05（a-d）。見圖2、3。

由圖3可見，HE染色結果顯示：Disrupted缺血再灌注組心肌的炎癥浸潤程度顯著高于Normal缺血再灌注組。

2.3 Normal缺血再灌注組與Disrupted缺血再灌注組心功能比較見圖4。

由圖4可見，和Normal缺血再灌組相比，Disrupted缺血再灌注組心功能受損更嚴重，LVEDd和LVESd顯著增加（均P＜0.05），LVEF和LVFS顯著下降（均P＜0.05）。

3 討論

近年來作息規律差、晝夜顛倒、倒班、晚睡的人群不斷增加，這些人的自身晝夜節律已長時間受影響。2012的一項薈萃分析表明，倒班人群的心肌梗死相對風險是1.23，發生心血管事件的相對風險是1.41[13]。PCI目前已成為冠心病主要治療手段，特別是在急性心肌梗死患者中，急診PCI是冠脈血管再通的主要手段，能顯著降低急性心梗病死率和改善患者心臟功能。但再灌注損傷仍是不可回避的問題，再灌注導致心肌氧自由基增加，鈣超載，線粒體膜通透性增加、能量代謝紊亂、加重局部的炎癥反應，促進細胞的凋亡[14-15]。

圖2 飼養4周后4組小鼠心臟炎癥因子表達的比較（與Normal組比較，*P＜0.05；與 Normal缺血再灌注組比較，△P＜0.05；與Disrupted 組比較，▲P＜0.05）

圖3 飼養4周后4組小鼠心肌組織病理檢查結果比較

圖4 Normal缺血再灌注組與Disrupted缺血再灌注組心功能比較（a:M型超聲心動圖；b-e:LVEDd、LVESd、LVEF、LVFS；與Normal缺血再灌注組比較，*P＜0.05）

炎癥反應的加重是心臟缺血再灌注損傷加重的重要原因，伴隨著再灌注血流，滲漏的中性粒細胞和促炎因子到達缺血部位[16-17]，炎癥因子IL-1β和TNF-α可以直接作用于心肌細胞上，加重心肌損傷[18-19]，TNF-α和IL-6可以誘導炎癥細胞分泌可溶性促炎因子C5a、甲酰肽、血小板活化因子[20]。滲漏的中性粒細胞通過彈性蛋白酶、蛋白水解酶、超氧自由基等加重心肌損傷[20-22]。心臟缺血再灌注后，缺血心肌IL-8的水平在再灌注1h后就開始上升，并持續24h至數天，另外，重組的IL-8可以增加中性粒細胞對心肌細胞的黏附性，直接損傷心肌[23]。急性心肌梗死激發區域性和系統性先天免疫反應是心肌愈合過程必不可少的，但區域性的過度炎癥反應可增加組織損傷促進心肌細胞死亡[24]。

c-Jun氨基末端激酶（JNK）是絲裂原活化蛋白激酶家族的一員，能控制炎癥、增殖、細胞分化與凋亡。JNK主要通過增加Bcl-2家族Bad蛋白的去磷酸化來調控炎癥反應及細胞凋亡[24]。目前研究已證實在心肌缺血再灌注損傷中，MIF可以通過上調BAD的磷酸化抑制JNK調節的信號通路，減少心肌梗死面積[25]。用MIF基因敲除的小鼠發現，在心肌缺血再灌注中，MIF的缺失能激活JNK活性增加肌心梗死面積，這一作用能被外源性重組MIF逆轉。即使使用茴香霉素激活心肌細胞JNK通路，使其發生磷酸化，JNK的活性仍可以被外源性加入的重組MIF蛋白所抑制[25]。可見MIF在心臟缺血再灌注中具有抗炎抗凋亡作用。

此外，晝夜節律失調影響小鼠免疫組織（胸腺、脾臟、腹腔巨噬細胞）的核心時鐘基因節律，導致脂多糖誘導的血液炎癥因子水平升高[26]。短期打亂心肌梗死小鼠的晝夜節律，導致其血漿中的IL-6水平和心肌IL-6mRNA的表達情況和正常小鼠相比均發生不同程度的變化[9]。心肌梗死區急性期炎癥的反應有利于心肌的存活和修復，然而持續高水平的炎癥反應反而損傷心肌增加纖維化，影響心肌的修復[27-29]。

我們用4周時間的黑暗環境暴露來打亂小鼠的晝夜節律，實驗結果顯示持續黑暗（Disrupted組）小鼠心肌MIF的表達顯著下降，同時心肌炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-8較晝夜交替（Normal組）顯著升高，經過缺血再灌注處理后持續黑暗小鼠心臟的炎癥因子表達較晝夜交替小鼠缺血再灌注情況下更高。已有研究表明炎癥因子是參與心肌缺血再灌注損傷的一個重要因素[19,20]，這和我們的研究結果是一致的。打亂小鼠的晝夜節律使全身免疫功能失調，導致心肌MIF表達的水平下降，同時心肌炎癥因子水平增高，心臟缺血再灌注后，MIF抗炎作用下降，增加心肌局部IL-6、TNF-α、IL-8等炎癥因子的表達水平，加重的炎癥反應增加局部組織損傷促進心肌細胞壞死，使心功能受損加重。

綜上所述，我們實驗證實了長時間的黑暗環境暴露打亂了小鼠的晝夜節律，并且進一步導致小鼠心臟缺血再灌注損傷加重。其中的機制可能是通過下調心肌局部MIF蛋白的表達，從而增加心臟缺血再灌注后IL-6、TNF-α、IL-8等炎癥因子水平，加重心肌局部炎癥反應，加重心功能損傷。

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