動脈粥樣硬化患者NLRP3炎性體分子表達及臨床意義

陳國偉 吳小蘭 陳冬梅 沈榮興 陳建忠

動脈粥樣硬化多由脂肪代謝紊亂、神經血管功能失調引起，常導致血栓形成、供血障礙等，為老年人主要病死原因之一。局部及全身炎癥反應在動脈粥樣硬化的發生、發展中發揮重要作用[1]，尤其是免疫應答介導的炎癥反應[2-3]。炎性體是由模式識別受體如核苷酸結合寡聚化樣受體（NLRs）識別配體如病原體相關模式分子（PAMPs）或危險相關模式分子（DAMPs）后與斑點樣蛋白（ASC）、半胱天冬酶-1（caspase-1）等形成的大分子的復合物[4-5]，炎性體形成后能激活caspase-1，活化的caspase-1繼而通過酶切IL-1β和IL-18前體分子而生成具有生物學活性的IL-1β和IL-18，進而調節炎癥反應。近年來有學者提出含熱蛋白結構域3的核苷酸結合寡聚化樣受體（NLRP3）介導的炎性體激活途徑在動脈粥樣硬化發生、發展過程中起著重要的作用[6-13]。本研究通過觀察動脈粥樣硬化患者NLRP3炎性體相關分子如NLRP3、ASC、IL-1β的表達及其并用膽固醇結晶誘導巨噬細胞活化產生IL-1β和TNF-α的水平，探討NLRP3炎性體活化途徑在動脈粥樣硬化發病中的作用。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2016年1月至2016年12月在桐鄉市第二人民醫院門診及住院的動脈粥樣硬化患者共40例設為實驗組，其中男23例，女17例，年齡49～84歲（69.9±9.6）歲；均經超聲檢查確診。入選標準：血管內膜增厚，內-中膜厚度1.0～1.2mm或管腔內粥樣硬化斑塊形成、管腔狹窄；排除標準：（1）有急性感染的臨床表現；（2）嚴重腎功能衰竭；（3）患有痛風、類風濕疾病、糖尿病、惡性腫瘤或其他嚴重消耗性疾病；（4）長期服用激素或免疫抑制劑的患者。選取桐鄉市第二人民醫院同期健康體檢者40例作為對照組，其中男24例，女16例，年齡50～80（68.6±11.1）歲。兩組對象性別、年齡等基線資料比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）,見表1。

表1 兩組對象的主要基線資料比較

1.2 方法

1.2.1 血漿細胞因子檢測 采集清晨空腹靜脈血5ml，肝素抗凝，收集血液后，以1 200r/min離心10min，分離血漿將血漿置于EP管（美國，Axygen,Y3700），置于-20℃冰箱保存。用ELISA試劑盒檢測血漿中IL-1β（美國，eBioscience，85-88-7261-22）、IL-18（美國，e－Bioscience，85-BMS267-2） 和 IL-37（美國，Invitrogen 88-52103）濃度，按試劑盒說明書操作，酶標儀（Molecular Devices，SynergyMx M5） 測定 450nm 處吸光度（A）值，以試劑盒提供的標準品測定結果繪制標準曲線，計算細胞因子的含量。

1.2.2 定量PCR檢測巨噬細胞（MDM）中NLRP3炎性體相關分子mRNA的表達 采集靜脈血5ml，肝素抗凝，將細胞用PBS稀釋1倍后，加入至含淋巴細胞分離液（挪威，Stemcell，LymphoprepTM，#07851）的離心管中，采用密度梯度離心法分離兩組患者的單個核細胞，分化為MDM，根據TRIzol試劑盒（康為，CW0580S）說明書提取總RNA，加入20μl的DEPC水溶解，測定RNA的濃度和OD比值，符合要求后按SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒（康為，CW0741M）說明書進行逆轉錄反應，20μl反應體系中包括 dNTP mix 4μl，SuperRT 1μl，5×RTBuffer 4μl，RNA 2μl，引物 2μl，DEPC 水 7μl，反應物4℃儲存待用。實時熒光定量PCR根據參考文獻進行，20μl反應體系中含 SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（2×）10μl，PCR上游和下游引物各1μl，逆轉錄反應液（cDNA溶液）2μl，DEPC 水 6μl，在定量 PCR 儀（Applied Biosystems,7900）上進行反應，反應條件為 95℃，30s；95℃，5s；60℃，34s，40 個循環，每個樣品設定 3 個復孔，并使用溶解曲線分析引物特異性。用2-△△Ct法計算出每組樣本的基因表達量，每種檢測重復3次。引物根據文獻報道設計和合成（上海生工生物工程技術有限公司），序列見表2。

表2 引物序列

1.2.3 膽固醇刺激MDM產生細胞因子的檢測 用膽固醇結晶（美國，Sigma-Aldrich，C8667）刺激 MDM，收集MDM細胞上清液，用ELISA方法檢測TNF-α（美國，eBioscience，85-88-7346-22）、IL-1β 的含量。實驗按試劑盒說明書操作，酶標儀測定450nm處吸光度（A）值，以試劑盒提供的標準品測定結果繪制標準曲線，計算細胞因子的含量。

1.3 統計學處理 采用SPSS11.5統計軟件,正態分布的計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組對象血漿中細胞因子含量的比較見表3。由表3可見，實驗組動脈粥樣硬化患者的IL-1β和IL-18的水平顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。而IL-37水平略高于對照組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 兩組對象血漿中細胞因子含量的比較

2.2 兩組對象MDM NLRP3炎性體相關分子表達水平比較見表4。

表4 兩組MDM NLRP3炎性體相關分子表達水平比較

由表4可見，實驗組NLRP3、ASC、IL-1β的mRNA表達顯著高于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

2.3 兩組對象MDM經膽固醇結晶刺激后產生細胞因子水平的比較見表5。

表5 兩組對象MDM經膽固醇結晶刺激后細胞因子水平的比較

由表5可見，實驗組分離的MDM經膽固醇結晶刺激后TNF-α、IL-1β的分泌水平均顯著高于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

3 討論

動脈粥樣硬化是一種以脂質沉積、白細胞浸潤和血管平滑肌細胞增殖為主要特征的慢性炎癥性疾病，但是到目前為止，動脈粥樣硬化患者粥樣損傷時炎癥反應的發生機制尚未完全闡明[1]，免疫應答引起的炎癥反應與其密切相關[2-3]。近年來研究表明，損傷的組織和細胞產生的損傷/DAMPs能被模式識別受體（PRR）識別后介導炎癥反應的發生。這些模式識別受體包括TLR、NLR、RLR和CLR等，其中NLR識別DAMPs后能形成由NLR、ASC、caspase-1等形成的稱為炎性體的分子復合物[14]。炎性體形成后能激活caspase-1，活化的caspase-1繼而通過酶切IL-1β和IL-18前體分子而生成具有生物學活性的IL-1β和IL-18，進而調節炎癥反應。NLRP3炎性體[15]是研究最多的一種，NLRP3炎性體由NLRP3、ASC和caspase-1組成。多種內源性刺激物如膽固醇結晶、葡萄糖、游離脂肪酸、尿酸鈉（MSU）結晶及胞質外ATP和外源性刺激物如細菌、病毒等成分能誘導NLPR3的活化，通過誘導促炎性細胞因子如IL-1β的產生，在如動脈粥樣硬化[6-10]、糖尿病[16-17]等免疫炎癥性疾病中的發病過程中起著重要的作用。如臨床報告發現，血液中IL-1β和IL-18的升高程度與冠狀動脈病的嚴重度密切相關。

動脈壁的慢性炎癥是動脈粥樣硬化發生的關鍵環節，單核細胞浸潤是動脈壁中粥樣斑塊的發生的基本特征。近來研究發現固有免疫細胞如MDM、內皮細胞吞噬游離脂肪酸（FFA）、膽固醇結晶后，可激活炎性體途徑，釋放炎癥因子如IL-1β、TNF-α等，在動脈粥樣硬化的發生、發展中起重要的作用[6-10]。本研究顯示，動脈粥樣硬化患者血漿中的IL-1β和IL-18的水平顯著高于對照組，提示動脈粥樣硬化患者可能存在慢性低度炎癥狀態。IL-37是新近發現的具有抗炎癥作用的細胞因子[18]，本研究結果顯示，動脈粥樣硬化患者血漿中IL-37水平僅略高于對照組，但無統計學差異，提示IL-37可能是為了調節炎癥應答而代償性升高。IL-1β和IL-18的產生依賴于NLRP3炎性體的激活，而炎性體的激活需要二個階段，即NLRP3炎性體相關分子的誘導表達階段和激活階段，研究發現修飾的LDL如氧化可被MDM的TLR和清道夫受體識別并作為初始信號誘導NLRP3和IL-1β的表達[8,9]，本研究將外周血單個核細胞分離后進一步分化為MDM，采用實時熒光PCR檢測MDM中NLRP3、ASC、IL-1 mRNA表達，同樣發現動脈粥樣硬化患者MDM 的 NLRP3、ASC、IL-1β的 mRNA表達顯著高于對照組，與早期研究發現冠狀動脈病患者外周血單個核細胞和皮下脂肪組織的NLRP3、IL-1β、IL-18等分子表達升高結果一致[19-21]。為進一步研究動脈粥樣硬化患者MDM對膽固醇結晶刺激的敏感性，體外用一定濃度的膽固醇結晶刺激后發現動脈粥樣硬化患者MDM的TNF-α、IL-1β分泌水平均顯著高于對照組，提示動脈粥樣硬化患者的MDM吞噬膽固醇或FFA后導致NLRP3炎性體的激活并促進IL-1β、TNF-α的產生，以上結果提示由膽固醇結晶刺激引起的炎性體激活途徑可能在動脈粥樣硬化硬化的發生、發展中起重要的作用。有關膽固醇結晶激活NLRP3炎性體的分子機制，有學者推測膽固醇結晶被巨噬細胞MDM吞噬后可導致吞噬溶酶體的不穩定性或破裂，引起溶酶體的組織蛋白酶B釋放，組織蛋白酶B和鉀離子外流、反應性氧代謝產物一起介導NLRP3炎性體的活化[8,9]。

近來研究發現炎性體活化途徑抑制劑在炎性體相關疾病的治療中取得較好的效果[22-23]，最近文獻報道常用于冠心病治療的藥物他汀類藥物能抑制NLRR3炎性體的激活而發揮抗炎作用[10-24]，這些發現為進一步研制開發有效的動脈粥樣硬化治療藥物提供了一定的理論依據和實驗基礎。

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