慢性阻塞性肺疾病大鼠血液中炎癥因子和神經相關分子水平的變化和意義

王小川 黃旭晴 高忠明 陶陳娟 姜海波

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種氣流受限為特征的慢性呼吸系統疾病。近年來，COPD肺外系統病變也得到了廣泛的重視[1]。研究發現，全身不良反應是COPD高發病率和高死亡率的主要原因。腦組織對缺氧極其敏感。COPD由于不可逆的氣流受限，造成腦部長期慢性缺氧，最終會導致腦細胞損傷。另外，COPD患者全身系統性炎癥也會加劇腦神經損傷[2]。我們前期研究發現，COPD患者長期缺氧導致了腦灰質細胞的丟失和體積減小[3-4]。本研究通過建立動物模型觀察COPD腦損傷對外周血中炎癥因子和神經相關分子水平變化，為臨床COPD中樞病變的早期診斷、病情惡化和預后及治療提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料 2月齡雄性SD大鼠（200～250g）購于浙江大學實驗動物中心。40只大鼠采用隨機數字表法分成COPD組和對照組各20只。大鼠飼養室溫控制在（23±1）℃，自由飲水和進食。COPD組大鼠建模：COPD組大鼠放置在熏煙箱（80cm×60cm×50cm）里連續煙熏4個月（3次/d，10支香煙/次，每次0.5h）。對照組除正常飼養外不作處理。

1.2 方法

1.2.1 肺功能檢測 采用小動物肺功能儀（FinePointeTMNAM，Bucxo公司，美國）測試大鼠肺功能。3.5%的戊巴比妥鈉腹腔注射（0.1ml/100g）麻醉，氣管插管連接Bucxo數據記錄分析系統。平靜呼吸后，在呼氣末以注射器經三通管迅速以相當于潮氣量5倍的氣量充氣，然后立即脫開，連接負壓（-25cm H2O）抽氣造成深呼氣。充氣和抽氣所引起的容積變化經計算機處理后計算出肺功能各項指標。

1.2.2 肺組織病理檢查 肺功能測試后，兩組大鼠立即斷頭處死。取左、右肺中葉依次經過多聚甲醛固定、脫水和石蠟包埋處理，組織5μm厚切片后脫蠟進行HE染色。

1.2.3 大鼠各指標檢測 肺功能測試后大鼠斷頭取血，7 000r/min 4℃低溫離心10min，取上清液-80℃保存。γ 干擾素（IFN-γ）、IL-1β、IL-6、C 反應蛋白（CRP）、TNF-α、中神經絲蛋白（NF）、神經特異性烯醇化酶（NSE）、Tau蛋白、腦鈉素（BNP）、大鼠髓磷脂相關糖蛋白（MAG）、髓鞘堿性蛋白（MBP）和少突膠質細胞髓鞘糖蛋白（OMgp）試劑盒由美國ADL公司。采用多功能免疫熒光分析系統（芬蘭WALLAC公司VICTOR 21420型）；采用雙抗體夾心酶聯免疫法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法嚴格按照說明書操作測定各指標。

1.3 統計學處理 應用SPSS 16.0統計軟件，計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組肺功能指標比較 與對照組比較，COPD組第50秒呼出容積占用力肺活量之比（FEV50/FVC%）為（33.0±2.8）%，明顯低于對照組的（39.1±6.4）%，兩組比較差異有統計學意義（t=3.441，P＜0.01）；COPD 組大鼠功能性殘氣量（FRC）為（6.0±0.7）ml，高于對照組的（3.7±1.1）ml，兩組比較差異有統計學意義（t=6.975，P＜0.01）。

2.2 兩組大鼠肺組織病理改變見圖1。

圖1 兩組大鼠肺組織病理改變（a：對照組；b：COPD組）

由圖1可見，COPD組氣道壁明顯炎癥細胞浸潤及杯狀細胞增生，氣道平滑肌和纖維組織明顯增多，氣道黏膜脫落，管腔狹窄，嚴重肺氣腫形成。

2.3 COPD組大鼠外周血炎癥因子水平變化見表1。

表1 COPD組大鼠和對照組大鼠外周血炎癥因子水平變化

由表1可見，COPD組血漿IFN-γ、IL-1β、IL-6、CRP和TNF-α均高于對照組，兩組比較差異均有統計學意義（P＜0.01）。

2.4 兩組大鼠外周血神經相關分子水平變化見圖2。由圖2可見，COPD組血漿NF、NSE、Tau蛋白、BNP、MAG、MBP及OMgp水平均高于對照組，兩組比較差異均有統計學意義 （t=6.380、8.079、8.079、8.079、6.000、6.692、6.448、2.041，均 P＜0.05）。

2.5 COPD組大鼠外周血炎癥因子與神經相關分子的相關性見圖3。

由圖3可見，COPD組大鼠MAG與IL-1β、BNP與IL-6、BNP 與 CRP 均呈顯著正相關（r=0.595、0.386、0.429，均P＜0.05）；對照組大鼠MAG與IL-1β、BNP與CRP呈顯著正相關（r=0.436、0.618，均 P＜0.05）。

3 討論

國內外的資料分析均揭示吸煙是COPD形成的最主要危險因素[5-6]。在我國，吸煙者COPD患病率（15.7%）遠高于不吸煙者（5.4%）[5]。本研究中，利用被動吸煙，我們成功地誘導了大鼠肺組織COPD病理改變及氣腫樣肺功能表現。吸入香煙中所含的尼古丁、亞硝胺、焦油和一氧化碳等有害物質均可引起呼吸道炎癥反應，呼吸道內黏液分泌增加，進而阻塞氣流通暢[7]。

圖2 兩組大鼠外周血神經相關分子水平變化（a：NF；b：NSE；c：Tau 蛋白；d：BNP；e：MAG；f：MBP；g：OMgp）

圖3 兩組大鼠外周血中炎癥因子（IL-1β、IL-6和hs-CRP）與腦細胞釋放分子（MAG和BNP）的相關性分析散點圖

我們的研究揭示吸煙可以引起機體全身性炎癥反應。這種炎癥反應也可能反過來加重COPD的癥狀[8-9]。與我們在COPD組大鼠中發現相似，劉正會和李麗的研究表明，COPD患者外周血中CRP、IL-6和TNF-α的水平顯著高于健康對照組。范春紅等發現，COPD患者血清CRP、IL-1β和IL-17濃度水平較健康對照組均顯著升高。Sebastian等[10]觀察到在COPD穩定期患者血漿中CRP、IL-6、IL-8和TNF-α水平都顯著升高，且IL-6和TNF-α的水平與疾病嚴重程度成正比。最近的研究[11]表明炎癥因子IL-17和轉化生長因子（transforming growth factor-beta，TGF-β）在 COPD 也顯著升高。

與我們在COPD的發現類似，磁共振研究發現，急性高原暴露1個月人群和缺氧性發作性全面性遺忘癥患者也存在低氧導致的腦損傷[12-13]。模擬海拔6 000M高原的低氧暴露大鼠腦內海馬齒狀回神經細胞發生了嚴重凋亡[13]。低氧情況下，神經細胞可通過改變其能量代謝，調節細胞內信號通路分子如蛋白激酶B（Akt）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、一氧化氮及一氧化碳，調節腦源性神經營養因子（BDNF）及促紅細胞生成素（EPO）和它的受體來應對低氧的影響[14]。低氧腦損傷的機制包括誘導神經細胞凋亡或自噬、釋放氧自由基（ROS）產生氧化應激、活化PARP caspase非依賴途徑誘導細胞死亡、激活小膠質細胞產生細胞毒性反應及免疫反應[15]。

研究表明，炎癥反應過程是許多神經系統疾病，如精神疾病、癲癇、癡呆和神經退行性疾病的病因，并與疾病的臨床發展相關[16]。慢性炎癥能夠破壞血腦屏障的緊密連接，因此使得外周血的促炎癥因子進入腦內并激活小膠質細胞[17]。激活的小膠質細胞導致神經絲蛋白和髓鞘堿性蛋白丟失，進而發生腦室周圍腦白質軟化。在小鼠模型中發現，小膠質細胞能表達上皮模式識別受體如Toll樣受體（TLR）1-9，神經元細胞可表達 TLR2、3、4、8。小膠質細胞介導的神經損傷依賴于TLR2和TLR4的完整表達。靜態的小膠質細胞受到TLR激動劑激活，啟動細胞因子和趨化因子的迅速上調。一些細胞因子也可以透過血腦屏障主動轉運，或者由內皮細胞產生繼而釋放入鄰近腦組織中[18]。

香煙中大量的細胞毒素，如一氧化碳、乙醛、亞硝胺和苯二酚等，可能直接導致了腦組織中神經細胞和膠質細胞的損害[19]。研究表明，吸煙可誘導Fas蛋白介導的大鼠腦組織細胞凋亡[20]。在阿爾茨海默病大鼠，吸煙后大鼠海馬神經元損傷明顯加重，膠質細胞變性明顯[21]。體內、體外實驗都證明暴露在煙霧中的缺血小鼠腦血流灌注能力以及毛細血管的密度均顯著下降，在煙霧中暴露的缺血小鼠的HIF-1α和VEGF的表達量顯著減少[22]。

總之，我們的研究揭示COPD可以導致腦神經細胞和膠質細胞同時受損。腦組織的損傷可能是COPD慢性缺氧、外周和腦內炎癥因子及煙霧所含細胞毒素的共同作用結果。我們的研究結果為臨床外周血檢測COPD腦損傷及對其針對性治療提供了理論依據。

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