H3K27me3聚集MEG3 lncRNA啟動子通過MDM2/p53途徑誘導多發性骨髓瘤RPMI8226細胞凋亡逃逸

董娟娟，彭萬仁，顏兵雪，錢婷婷，蔡謎謎，王 華， 孫國平

多發性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是造血干細胞的惡性克隆性疾病，具有極強的異質性，涉及諸多發病環節。MM發生涉及細胞增殖、凋亡、分化、周期轉換等異常過程中，組蛋白甲基化/去甲基化修飾平衡功能紊亂發揮舉足輕重的作用[1-5]。組蛋白甲基化修飾狀態與細胞凋亡的發生關系密切。研究[6]顯示，長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)作為新型表觀遺傳學調控方式，可與組蛋白甲基化相互調節。通過此方式兩者共同參與染色質重構、轉錄激活、轉錄干擾等多種重要的調控過程。母系表達基因3 (materially expressed gene 3，MEG3) lncRNA是一個被證實具有腫瘤抑制功能的長鏈非編碼RNA，在57%的MM患者中表達缺失[7]，但其作用機制尚不清楚?，F將重點探討MM中MEG3 lncRNA基因啟動子區域組蛋白H3賴氨酸殘端27位的三甲基化(H3K27me3)表達情況，明確基因啟動子區域H3K27me3修飾紊亂是否導致MM中MEG3 lncRNA轉錄缺失，從而為MM的臨床治療尋找新的方向。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑MTT、碘化丙啶(PI)、DMSO、RNaseA、Hoechst 33258熒光染液均購自美國Sigma公司產品; RNA抽提試劑TRIzol、RPMI 1640培養基均購自美國Gibco公司; 胎牛血清(FBS)購自杭州四季青生物工程材料有限公司; Annexin-V FITC/PI 試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司; 引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒購自日本Toyobo 公司; 抗體Zeste基因增強子同源物2(enhancer of Zeste homolog 2,EZH2)、H3K27me3、鼠雙微體基因2(murine double minute 2,MDM2)、p53和ubiquitin-p53購自美國Cell Signaling公司; 氯仿、乙醇、異戊醇為國產分析醇，購自杭州長征化學試劑有限公司。

1.2儀器BD流式細胞儀、Bio-Rad M450 酶聯免疫檢測儀購自美國CA公司; ChemiDocXRS 蛋白條帶密度分析軟件購自美國Bio-Rad 公司；Real-time PCR儀器購自羅氏公司。

1.3細胞培養RPMI8226細胞購自武漢大學保藏中心，用含100 U/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素、10%滅活FCS的RPMI1640培養基, 在5% CO2、37℃、飽和濕度條件下培養, 根據細胞數量，每2～3 d 換液傳代1次, 倍增時間24～48 h, 取細活性>95%的對數生長期細胞用于后續各項實驗。

1.4MTT比色法檢測細胞增殖收集處于對數生長期的RPMI8226細胞，調整細胞濃度至2×105/ml，在96孔板中每孔加入體積200 μl該細胞懸液,邊緣孔用無菌PBS填充。細胞分為MDM2拮抗劑干預組、p53拮抗劑干預組和DMSO干預組, 按要求時間在5% CO2、37 ℃、飽和濕度條件下孵育，每孔加入 5 mg/ml 的 MTT 20 μl, 繼續37 ℃孵育4～6 h。離心棄上清液，小心用PBS沖2～3次后，每孔加入 150 μl DMSO, 置搖床上低速振蕩10 min,在藍色結晶充分溶解后, 在Bio-Rad M450酶聯免疫檢測儀以OD492 nm波長測量各孔的吸光度(A)值, 重復實驗 3次, 按公式：抑制率=1-實驗組A值/對照組A值，計算細胞增殖抑制率。

1.5Annexin-VFITC/PI雙標法流式細胞術檢測細胞凋亡按實驗設計收集經siRNA-EZH2處理后RPMI8226細胞，同時設計陰性對照組(DMSO處理), 經4 ℃預冷的PBS離心洗2次, 按1×106/ml密度于100 μl 的 buffer結合緩沖液中重懸細胞, 分別加入 Annexin-V FITC 5 μl和PI 10 μl , 震蕩混勻, 室溫避光條件下反應15 min, 再加入buffer結合緩沖液至300 μl, 樣品制備完畢后上流式細胞儀檢測。

1.6RT-PCR法檢測EZH2、MEG3lncRNA及MDM2和p53表達按試劑盒說明書合成cDNA。按以下條件進行逆轉錄反應：30 ℃、10 min, 42 ℃、20 min, 99 ℃、5 min, 4 ℃、5 min, -20 ℃保存。EZH2引物序列：上游引物5′-GGACCACAGTGTTACCAAGCAT-3′,下游引物5′-GTGGGGTCTTTATCCGCTCAG-3′, 擴增產物為79 bp；MDM2 引物序列：上游引物5′-CAGTAGCAGTGAATCTACAGGGA-3′, 下游引物5′-CTGATCCAACCAATCACCTGAAT-3′, 擴增產物為79 bp；MEG3lncRNA引物序列：上游引物5′-ATCATCCGTCCACCTCCTTGTCTTC-3′,下游引物5′-GTATGAGCATAGCAAAGGTCAGGGC-3′, 擴增產物為284 bp; β-actin 引物序列:上游引物5′-TGAGACCTTCAACACCCCAG-3′,下游引物5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3′, 擴增產物為206 bp；以cDNA為模板, 進行MEG3 lncRNA、MDM2的PCR擴增。取擴增產物5 μl, 經瓊脂糖凝膠電泳、紫外線照相、Bandscan軟件進行掃描分析, 得出目的基因的灰度值進行半定量分析。

1.7Westernblot檢測EZH2、H3K27me3、MDM2及p53蛋白表達將各處理組細胞收集至50 μl加入苯甲基磺酰氟和蛋白酶抑制劑的冷細胞裂解液中，以提取細胞總蛋白。按照Bio-Rad 試劑盒使用說明書標定Marker蛋白及各泳道，電泳。在300 mA電流15 min的條件下轉膜，取出硝酸纖維素膜置于5%脫脂牛奶中4 ℃過夜封閉。加入稀釋的抗靶蛋白抗體與膜共同孵育(37 ℃)1 h。取出纖維素膜洗滌后，再與辣根過氧化物酶標記的二抗共孵育(37 ℃)1 h。洗滌后，曝光，X光片掃描定影，輸入計算機。

1.8ChIP-RealtimePCR技術收集各處理組細胞；細胞固定，直接將甲醛加入細胞培養液，搖晃固定10 min后，迅速加入2.5 mol/L甘氨酸解交聯5 min，PBS洗滌，刮下細胞。超聲打碎：使用超聲水浴鍋，EP管在冰水混合物中超聲，將長鏈的DNA打碎成200～1 000 bp的DNA片段。4 ℃、5 000 r/min離心5 min后去上清液。免疫沉淀：加入ChIP級H3K27me3抗體和對照IgG，和結合抗體的磁珠(或protein A/G)。經稀釋后，超聲產物分成兩份，分別加入ChIP級H3K27me3抗體和對照IgG，輪轉過夜，第2天加入磁珠輪轉4 h。洗滌：順序分別用稀釋緩沖液、低鹽溶液、高鹽溶液、氯化鋰溶液以及TE緩沖液洗滌，共兩個循環。用洗脫緩沖液在65 ℃洗脫，過夜。DNA純化：將洗脫的產物用DNA純化試劑盒純化，得到50 μl純化產物DNA。

根據MEG3 lncRNA基因區域上游2 000～3 000 bp范圍分段設計引物，每300 bp設計一套，共合成8～10套引物。將ChIP以后的Input、IgG、IP三個樣本分別用10個引物進行半定量PCR的篩選，如果IP組的樣本某套引物能P出條帶，說明H3K27me3和MEG3 lncRNA啟動子區域的這段序列存在結合。再運用QPCR定量富集倍數：將半定量電泳PCR篩選出來的有結合的引物，再用Input和IP樣本進行QPCR驗證，計算得出ChIP富集的倍數。

1.9siRNA干擾技術轉染前1 d，常規消化細胞，制成細胞懸液、計數，在6孔板內鋪上1.2×105個細胞，加入1 500 μl 無抗生素培養基培養 24 h，到轉染時使細胞達到 30%～50%的匯合率。三組分別將EZH2-siRNA(EZH2為H3K27me3特異性的組蛋白甲基轉移酶)、siRNA 陰性對照、NC siRNA各5 μl溶于250 μl無血清的 Opti-MEM溶液中，輕柔混合均勻。將5 μl Lipofectamine RNA IMAX溶于250 μl無血清的Opti-MEM中，混合均勻，在室溫下孵育5 min后，將上述兩種混合物輕輕混合均勻，并在室溫下孵育20 min。注意混合試劑時，請勿劇烈吹打或振蕩，手指輕彈管壁即可，用力過度可能會破壞siRNA的結構。在6孔板中棄去舊培養基,每孔加入1 500 μl 的無血清培養基，并將上述兩種混合物加入6孔板，上下左右輕輕晃動板子使得復合物混合均勻。細胞在37 ℃、5% CO2培養箱中培養，在加完復合物4～6 h后，可更換完全培養基。48 h后，收集細胞，提取蛋白，測量靶蛋白EZH2及H3K27me3的表達水平或進行其他實驗。

圖1 RPMI8226細胞中下調H3K27me3的表達可以誘導RPMI8226細胞凋亡

2 結果

2.1H3K27me3導致MM細胞凋亡逃逸EZH2是特異性的H3K27me3組蛋白甲基化轉移酶，合成特異性的EZH2-siRNA, 運用電轉染技術使EZH2-siRNA進入RPMI8226細胞內(同時設有陰性對照)特異性抑制EZH2的表達，運用Western blot技術檢測干擾后EZH2、H3K27me3的表達，結果顯示，通過干擾EZH2的表達可以明顯抑制H3K27me3的表達，見圖1A。 Annexin-V FITC/PI雙標法檢測H3K27me3對RPMI8226細胞凋亡的影響：早期凋亡細胞顯示為Annexin-V FITC標記為陽性，同時PI標記為陰性的細胞；然而，晚期凋亡細胞則為Annexin-V FITC與PI標記均為陽性的細胞群。與正常RPMI8226細胞組對比，EZH2-siRNA干預組H3K27me3蛋白表達明顯降低，見圖1A，凋亡的RPMI8226細胞數目明顯增多。正常RPMI8226細胞組的早期凋亡率、晚期凋亡率分別為(0.13±0.02)%和(0.26±0.02)%；EZH2-siRNA干預組的早期凋亡率、晚期凋亡率分別為(1.39±0.27)%和(19.9±0.71)%；正常組和干預組間細胞凋亡率有明顯差異(t=4.870,P<0.05)，見圖1B。

2.2ChIPReal-timePCR證實H3K27me3直接結合于MEG3lncRNA基因啟動子區本研究以RPMI8226細胞為樣本進行ChIP實驗。結果顯示，在上千個基因啟動子區域有高密度聚集的H3K27me3，其中包含很多癌相關基因。同時發現MEG3lncRNA啟動子區存在H3K27me3聚集。進一步運用ChIP Real-time PCR證實MEG3lncRNA啟動子區存在H3K27me3聚集，使用Graphpad Prism 5.0 軟件進行統計分析，H3K27me3組較Control IgG組明顯差異，提示H3K27me3可直接結合于MEG3lncRNA基因啟動子區，見圖2。

圖2 H3K27me3可直接結合于MEG3lncRNA基因啟動子區

2.3通過調控H3K27me3表達可上調RPMI8226細胞MEG3lncRNA表達水平RPMI8226細胞經EZH2-siRNA干預組作用后，細胞內MEG3lncRNA表達水平呈明顯升高，Control組 與siRNA-NC組干預后相比，兩組間MEG3lncRNA表達水平無明顯變化。但EZH2-siRNA干預后MEG3lncRNA表達水平是前者2倍，與Control組比較差異有統計學意義(P<0.05),見圖3。

圖3 抑制H3K27me3可上調RPMI8226細胞MEG3lncRNA表達水平

2.4通過調控RPMI8226細胞MEG3lncRNA表達可影響MDM2蛋白、mRNA水平RPMI8226細胞經MEG3lncRNA-siRNA干預組作用后，細胞內MDM2 mRNA表達水平呈明顯升高，Control組 與siRNA-NC組干預后相比，兩組間MDM2 mRNA表達水平無明顯變化。但MEG3lncRNA-siRNA干預后MDM2 mRNA表達水平是前兩者2倍，差異有統計學意義(P<0.05)。MEG3lncRNA-siRNA明顯上調mRNA表達水平的同時，同時有效誘導了MDM2蛋白表達。MEG3lncRNA-siRNA干預組作用后，細胞內MDM2蛋白水平呈明顯升高趨勢，差異有統計學意義(t=3.269，P<0.05)。siRNA-NC組干預后MDM2蛋白水平無明顯變化，見圖4。

2.5RPMI8226細胞中可通過拮抗MDM2相關的p53泛素化導致p53降解以MDM2拮抗劑(Nutlin-3)干預RPMI8226細胞后，應用Western blot檢測MDM2拮抗劑(Nutlin-3)對RPMI8226細胞的Ub-p53及p53蛋白水平調節變化；結果顯示，Nutlin-3可在蛋白水平上抑制p53的泛素化，故Ub-p53表達水平降低，使得p53降解被抑制，p53蛋白表達水平明顯升高，見圖5。Nutlin-3處理組與RPMI8226細胞未處理組(Control組)相比，差異有統計學意義(t=93.59，P<0.05)。

圖4 RPMI8226細胞經MEG3lncRNA-siRNA干預后MDM2 mRNA和蛋白表達水平均明顯升高

A：各組Western blot中MDM2蛋白水平；B：各組PCR中MDM2基因水平;與Control組比較：*P<0.05

圖5 MDM2拮抗劑(Nutlin-3)干預后RPMI8226細胞的p53與Up-p53表達

3 討論

表觀遺傳學在腫瘤發生、發展中作用堪比傳統遺傳學,表觀遺傳修飾的異常是所有人類腫瘤的共同特點。組蛋白甲基化酶和組蛋白去甲基化酶是表觀遺傳學的重要內容,機體通過兩者共同作用動態調節組蛋白甲基化模式,組蛋白甲基化模式是發揮表觀遺傳作用的重要方式之一,嚴格調控細胞的分化、增殖,維持機體細胞生命狀態的穩定, 在細胞凋亡、周期等生命過程中發揮重要作用[8], 其失平衡則導致腫瘤的發生。H3K27me3 生物體細胞中廣泛富集于基因啟動子區域, 介導染色質重構,染色質閉鎖,基因轉錄停止。也有報道稱除基因啟動子區域外, H3K27me3尚可存在于結構基因多個位點,維持染色質的濃縮狀態。

組蛋白甲基化酶復合物PRC2 的亞基 EZH2 在骨髓瘤中高表達, 其調控的H3K27me3水平在腫瘤的發生發展中起重要作用,靶向抑制EZH2可增加瘤細胞的凋亡率。圖1A實驗證實，通過siRNA技術抑制MM RPMI8226細胞中EZH2表達后, H3K27me3表達量顯著下降，同時RPMI8226細胞凋亡率明顯增加。徐莉 等[9]也證實RPMI8226及H929細胞系中的H3K27me3高表達會導致本細胞凋亡相關分子caspase3、PARP均呈低表達, 瘤細胞死亡率降低, 且同時對35例骨髓瘤患者標本進行Western blot分析, 證實EZH2、H3K27ME3的表達水平和骨髓瘤患者的疾病的惡性程度呈正相關。因此,推論H3K27me3的高表達保護了RPMI8226細胞的凋亡逃逸。

MEG3lncRNA作為第一個被發現有腫瘤抑制功能的lncRNA，證實在57% MM患者中表達缺失[7]，但其作用機制尚不清楚。LncRNA是新近發現的具有強大調控功能的基因組“暗物質”, 是一類轉錄長度超過200 nt的RNA分子, 起初因無蛋白質編碼功能，被認為是基因組轉錄的“噪音”[10]。由于近年研究的不斷深入，lncRNA功能學發現突飛猛進, 已證實lncRNA參與了染色質修飾、X染色體沉默、轉錄干擾、轉錄激活等多種重要的基因表達調控過程, 是重要的表觀遺傳學調控方式[11]。研究顯示lncRNA可與其他表觀遺傳形式相互作用,組蛋白甲基化可直接作用于lncRNA基因啟動子區來調控lncRNA的表達,反之,上游非編碼區轉錄出的lncRNA也可通過影響組蛋白甲基化/乙酰化等修飾狀態影響下游基因的表達。其表達缺失已被證實存在于多種腫瘤細胞系及實體腫瘤中。Benetatos et al[12]報道, 57%的MM病例MEG3 lncRNA基因啟動子存在異常的甲基化譜,且伴隨MEG3 lncRNA表達缺失,并且缺失程度與MM的亞型和疾病的階段具有顯著相關性。然而, MEG3 lncRNA表達缺失的原因及其在MM的發生、發展中作用機制目前仍未有研究。本實驗證實MM中H3K27me3可結合于MEG3 lncRNA基因啟動子區域，且通過siRNA技術抑制H3K27me3甲基化酶EZH2降低H3K27me3表達的同時，MEG3 lncRNA表達可明顯升高。因此推論，MM RPMI8226細胞中MEG3 lncRNA基因啟動子區H3K27me3的異常高表達，是MEG3 lncRNA表達缺失的重要原因。H3K27me3如何保護RPMI8226細胞的凋亡逃逸，是否與調控MEG3 lncRNA表達相關仍有待探索。

在神經膠質瘤中證實，人為使MEG3 lncRNA過表達可抑制腫瘤細胞的DNA合成及細胞集落的形成,抑制MDM2表達,誘導p53聚集,刺激p53介導的轉錄活化, 選擇性的調節p53下游靶基因 GDR-15(growth differentiation factor 15, GDF-15, 此基因具有抗增殖及腫瘤抑制功能)等的表達, 從而抑制細胞增殖,誘導凋亡[13-17]。多發性骨髓瘤中，MEG3 lncRNA異常低表達是否同樣引起MDM2的異?；罨皃53降解導致功能缺失，最終誘導MM逃避凋亡。本實驗中證實，RPMI8226細胞中H3K27me3表達被抑制時，MEG3 lncRNA表達升高，同時MDM2在mRNA及蛋白水平上均明顯降低。同樣運用siRNA技術證實，MEG3 lncRNA表達被抑制時，MDM2在mRNA及蛋白水平上均有所升高。本實驗還證實運用MDM2拮抗劑Nutlin-3可顯著降低蛋白水平泛素化p53的表達，非泛素化p53的蛋白表達有升高趨勢。由此推論，MM中MEG3 lncRNA表達缺失解除了對MDM2表達的抑制,MDM2再通過與p53直接結合介導p53泛素化,間接促使p53的降解, 或直接抑制 p53 基因活化,導致 MM 細胞凋亡逃逸。

[1] Liu Y, Zeng L L, Chen Y,et al.Triptolide inhibits cell growth and induces G0-G1 arrest by regulating P21wap1/cip1 and P27kip1 in human multiple myeloma RPMI-8226 cells[J]. Chin J Cancer Res,2010,22(2):141-7.

[2] Zeng R,Zeng L,Chen Y,et al.Triptolide-induced apoptosis by inactivating nuclear Factor-kappa B apoptotic pathway in multiple myelomainvitro[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci, 2011,31(4):446-51.

[3] Zhao F, Chen Y, Zeng L L,et al.Effects of triptolide on RIZ1 expression, proliferation, and apoptosis in multiple myeloma U266cells[J].Acta Pharmacol Sin,2010,31(6):733-40.

[4] Zhao F, Chen Y, Zeng L,et al.Role of triptolide in cell proliferation, cell cycle arrest, apoptosis and histone methylation in multiple myeloma U266 cells[J].Eur J Pharmacol,2010,646(1-3):1-11.

[5] Zhao F, Chen Y, Li R,et al.Triptolide alters histone H3K9 and H3K27 methylation state and induces G0/G1 arrest and caspase-dependent apoptosis in multiple myelomainvitro[J]. Toxicology,2010,267(1-3):70-9.

[6] Peffers M J, Balaskas P, Smagul A.Osteoarthritis year in review 2017:genetics and epigenetics[J].Osteoarthritis Cartilage,2017,26(3):304-11.

[7] Benetatos L, Dasoula A, Hatzimichael E,et al.Promoter hypermethylation of the MEG3 (DLK1/MEG3) imprinted gene in multiple myeloma[J].Clin Lymphoma Myeloma,2008,8(3): 171-5.

[8] Chen H,Landen C N, Li Y,et al.Epigallocatechin gallate and sulforaphane combination treatment induce apoptosis in paclitaxel-resistant ovarian cancer cells through hTERT and Bcl-2 down-regulation.[J].Exp Cell Res,2013,319(5):697-706.

[9] 徐 莉，陳協群.多發性骨髓瘤中組蛋白甲基化的分析研究[G].武漢:全國淋巴腫瘤診治進展研討會,2014.

[10] Bedoyareina O C, Ponting C P. Functional RNA classes: a matter of time[J].Nat Struct Mol Biol,2017,24(1):7-8.

[11] Bassett A R, Azzam G, Wheatley L,et al.Understanding functional miRNA-target interactionsinvivoby site-specific genome engineering[J].Nat Commun,2014,5:4640.

[12] Benetatos L,Dasoula A,Hatzimichael E,et al.Promoter hypermethylation of the MEG3 (DLK1/MEG3) imprinted gene in multiple myeloma[J].Clin Lymphoma Myeloma,2008,8(3):171-5.

[13] Wang P,Ren Z,Sun P.Overexpression of the long non-coding RNA MEG3 impairsinvitroglioma cell proliferation[J].J Cell Biochem,2012,113(6):1868-74.

[14] Zhou Y,Zhong Y,Wang Y,et al.Activation of p53 by MEG3 Non-coding RNA[J].J Biol Chem,2007,282(34):24731-42.

[15] Yan H,Yuan J,Gao L,et al.Long noncoding RNA MEG3 activation of p53 mediates ischemic neuronal death in stroke[J].Neuroscience,2016,337:191-9.

[16] Zhu J,Liu S,Ye F,et al.Long Noncoding RNA MEG3 interacts with p53 protein and regulates partial p53 target genes in hepatoma cells[J].Plos One,2015,10(10):e139790.

[17] Zhan R,Xu K,Pan J,et al.Long noncoding RNA MEG3 mediated angiogenesis after cerebral infarction through regulating p53/NOX4 axis[J].Biochem Biophys Res Commun,2017,490(3):700-6.