環(huán)巴胺對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響

黃焱平，曹 威，汪陶榮，張俊強(qiáng)，殷瞳昕，宋先兵，陳曉宇,

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatic arthritis，RA)表現(xiàn)為滑膜細(xì)胞過度增生，浸潤并破壞滑膜下軟骨組織或骨組織，病程遷延可導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)畸形和致殘。因此，RA治療的關(guān)鍵是降低關(guān)節(jié)軟骨和骨組織的破壞[1]。動物體內(nèi)普遍存在進(jìn)化保守的Hedgehog(Hh)信號通路，在胚胎期組織分化、腫瘤形成等方面作用廣泛[2]。研究[3-4]證實(shí)，Hh信號通路參與軟骨與骨發(fā)育和生長，骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)明顯的Hh信號通路的激活，基因沉默Hh信號通路后關(guān)節(jié)損傷癥狀得到緩解，有望成為新的骨關(guān)節(jié)炎治療手段。環(huán)巴胺(cyclopamine)為Hh通路抑制劑，目前對RA患者病變進(jìn)程中關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的影響研究報道較少。該研究擬建立大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis，AA)模型，觀察環(huán)巴胺在體外能否通過抑制Hh信號通路,影響AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖，旨在發(fā)現(xiàn)新的RA藥物作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物20只雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠，清潔級，體質(zhì)量(160±10)g，購自安徽省實(shí)驗(yàn)動物中心。環(huán)境溫度(24.5±1.0)℃、相對濕度(59.0±2.0)%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，依據(jù)安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物處理程序。

1.2主要試劑與儀器弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant，F(xiàn)CA)、環(huán)巴胺、羊抗鼠Shh多克隆抗體、羊抗鼠Ptch1多克隆抗體和羊抗鼠Gli1多克隆抗體(美國Sigma公司)；兔抗羊生物素二抗(北京中杉金橋有限公司)；總蛋白抽提試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；硝酸纖維素膜(美國Whatman公司)；顯影液、定影液、膠片(美國柯達(dá)公司)；Dulbecco 改良 Eagle 培養(yǎng)基(DMEM)(美國Gibco公司)；乙二胺四乙酸(EDTA)、羧甲基纖維素鈉為國產(chǎn)分析純?nèi)芤海籑ultikan FC型全自動酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher公司)；PV-200_足趾容積測量儀(成都泰盟軟件有限公司)。

1.3動物分組和模型制備雄性SD大鼠20只，隨機(jī)分為正常組和模型組，每組10只，模型制備參照文獻(xiàn)[5]報道，采取0.1 ml FCA左側(cè)足趾皮下注射制備AA模型，正常組注射等量生理鹽水。

1.4模型評定AA大鼠模型評價參照文獻(xiàn)[5]報道，主要利用足爪腫脹度和關(guān)節(jié)HE染色形態(tài)學(xué)檢查。足爪腫脹度測量應(yīng)用足容積測量儀，測量SD大鼠致炎前右側(cè)(非致炎側(cè))踝關(guān)節(jié)下容積，從致炎后第12～28天，每4 d測量繼發(fā)側(cè)足爪容積，足爪腫脹度(Δml)=繼發(fā)側(cè)注射后足爪容積-注射前足爪容積。HE染色觀察踝關(guān)節(jié)形態(tài)學(xué)改變，第28天處死大鼠后，取兩組大鼠踝關(guān)節(jié)浸入10%的甲醛溶液中固定24 h后，浸入含10% EDTA 的脫鈣溶液中脫鈣8周處理，大鼠踝關(guān)節(jié)常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、4 μm厚切片，HE染色，觀察兩組大鼠踝關(guān)節(jié)形態(tài)學(xué)改變。

1.5關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)和鑒定參照文獻(xiàn)[6]，采用胰酶聯(lián)合Ⅱ型膠原酶分離AA大鼠軟骨細(xì)胞，操作步驟如下，將大鼠踝關(guān)節(jié)浸泡75%乙醇中30 min后，在無菌操作臺中，去皮，小心剝離關(guān)節(jié)表面白色膜狀透明軟骨層，在無菌培養(yǎng)皿中先用37 ℃胰酶消化30 min，然后再用0.2% Ⅱ型膠原酶消化3 h，200目濾網(wǎng)過濾，1 500 r/min離心10 min，PBS洗3次，每次5 min。收集洗滌后的細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃飽和濕度的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，去除懸浮細(xì)胞，待貼壁細(xì)胞連接呈片狀時可應(yīng)用胰酶傳代培養(yǎng)。軟骨細(xì)胞的鑒定應(yīng)用甲苯胺藍(lán)染色、免疫細(xì)胞化學(xué)染色Ⅱ型膠原顯色，實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞為傳代培養(yǎng)3～5代的AA大鼠軟骨細(xì)胞。

1.6CCK-8法測定環(huán)巴胺處理后大鼠軟骨細(xì)胞增殖情況處于對數(shù)生長期的AA大鼠踝關(guān)節(jié)分離培養(yǎng)的透明軟骨細(xì)胞，含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基5×104/L接種于96孔板中，每孔100 μl，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)包括5組：每組環(huán)巴胺終濃度分別為0、0.03、0.3、3、10 μmol/L。37 ℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)44 h，然后每孔加入CCK-8溶液20 μl再培養(yǎng)4 h。取出培養(yǎng)板，應(yīng)用全自動酶標(biāo)儀，在波長為450 nm處測吸光度(absorbance，A)值A(chǔ)450，測定AA大鼠軟骨細(xì)胞的增殖情況，每組設(shè)5個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以試驗(yàn)測得的均值為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.7Hoechst33258染色檢測環(huán)巴胺處理后軟骨細(xì)胞凋亡情況取對數(shù)生長期的軟骨細(xì)胞，按照1×106/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，貼壁培養(yǎng)24 h后，軟骨細(xì)胞分4組：AA模型組(AA大鼠培養(yǎng)軟骨細(xì)胞未予藥物刺激)、環(huán)巴胺給藥組(環(huán)巴胺作用軟骨細(xì)胞，終濃度為 0.3、3、10 μmol/L)處理48 h，吸棄培養(yǎng)液，4%多聚甲醛溶液固定30 min；PBS清洗3次，每次5 min。棄去清洗液并吸干，每孔50 μl Hoechst 33258染色液，避光染色10 min，PBS清洗2次，每次10 min，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.8Westernblot法檢測環(huán)巴胺處理軟骨細(xì)胞對Shh、Gli1、Ptch1蛋白的影響25 ml培養(yǎng)瓶中按照3.0×106/瓶接種處于對數(shù)生長期的軟骨細(xì)胞，每瓶加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液5 ml，培養(yǎng)24 h 后，以加入完全培養(yǎng)基為對照組，給藥組按照加入不同濃度的環(huán)巴胺分為3組(環(huán)巴胺終濃度0.3、3、10 μmol/L)，37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，分離提取蛋白樣本，BCA法測定蛋白濃度，計(jì)算后取30 μg蛋白樣品作為上樣量檢測，SDS-PAGE膠電泳蛋白分離，濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上。TBST洗膜3次，每次10 min，5%的脫脂奶粉抗原封閉1 h后，再轉(zhuǎn)入雜交袋中，一抗(羊抗鼠Shh蛋白1 ∶1 000、羊抗鼠Gli1蛋白1 ∶1 500、羊抗鼠Ptch1蛋白1 ∶1 500，羊抗鼠β-actin蛋白 1 ∶1 500)多克隆抗體，4 ℃孵育過夜；次日室溫下，TBST洗膜3次，每次10 min；辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min；蛋白條帶半干電轉(zhuǎn)， ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光，暗室中顯影、定影、曝光壓片。凝膠分析成像系統(tǒng)軟件Band Scan 5.0對目的條帶和內(nèi)參條帶β-actin進(jìn)行灰度值檢測。蛋白檢測實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1大鼠繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎評價應(yīng)用足趾容量儀排水法檢測足爪腫脹度，HE染色觀察兩組大鼠繼發(fā)側(cè)關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的改變來評價繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎。足爪腫脹度觀察結(jié)果表明，與正常對照組比較， AA大鼠于第12天出現(xiàn)繼發(fā)側(cè)足腫脹，腫脹程度在20 d時最為明顯，在整個實(shí)驗(yàn)期間，對照組大鼠繼發(fā)側(cè)的足爪容積基本無改變，見圖1。大鼠繼發(fā)側(cè)踝關(guān)節(jié)HE染色表明，注射生理鹽水的對照組關(guān)節(jié)透明軟骨表面有薄層滑膜組織，軟骨細(xì)胞生活在軟骨陷窩中，由邊緣向中央軟骨細(xì)胞逐漸長大，可見同源細(xì)胞群，見圖2A；模型組大鼠踝關(guān)節(jié)見關(guān)節(jié)滑膜組織增生，關(guān)節(jié)腔減小或消失，增生的滑膜組織向滑膜下的軟骨和骨組織中侵襲，軟骨細(xì)胞在基質(zhì)中排列連續(xù)性破壞，呈排列紊亂狀態(tài)，見圖2B。

2.2AA大鼠透明軟骨細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定經(jīng)過分離培養(yǎng)的原代AA大鼠踝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞呈類圓形，12 h后細(xì)胞呈扁平多角形，細(xì)胞貼壁生長，72 h左右細(xì)胞完全貼壁，呈梭形或多邊形；生長1周左右時細(xì)胞連接呈片狀，可用胰酶消化傳代培養(yǎng)。軟骨細(xì)胞鑒定采用細(xì)胞化學(xué)和免疫組化技術(shù)，甲苯胺藍(lán)染色顯示：AA大鼠踝關(guān)節(jié)的透明軟骨細(xì)胞胞質(zhì)為淺藍(lán)色，核著色較胞質(zhì)深，呈藍(lán)色，胞質(zhì)中可見少許異染顆粒，見圖3A；進(jìn)一步鑒定采用免疫組化染色技術(shù)檢測Ⅱ型膠原表達(dá)情況，可見SD大鼠踝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞胞質(zhì)為黃色的Ⅱ型膠原陽性表達(dá)，見圖3B，以上鑒定結(jié)果證實(shí)本研究培養(yǎng)的細(xì)胞是關(guān)節(jié)透明軟骨細(xì)胞。

圖1 不同時間點(diǎn)AA大鼠繼發(fā)性足爪腫脹度(Δml)

圖2 大鼠踝關(guān)節(jié)腔形態(tài)學(xué)改變 HE×100

圖3 關(guān)節(jié)透明軟骨細(xì)胞鑒定

A: 甲苯胺藍(lán)染色呈陽性 ×200；B:免疫組化染色Ⅱ型膠原呈陽性表達(dá) ×400

2.3不同濃度環(huán)巴胺對AA大鼠軟骨細(xì)胞增殖的影響96孔培養(yǎng)板中，加入100 μl濃度為5×104/L的AA大鼠軟骨細(xì)胞懸液培養(yǎng)24 h后，加入環(huán)巴胺處理(終濃度為0、0.03、0.3、3、10、30 μmol/L)軟骨細(xì)胞48 h后，CCK-8檢測細(xì)胞增殖，結(jié)果表明，環(huán)巴胺可促進(jìn)AA模型組軟骨細(xì)胞增殖，且隨著環(huán)巴胺處理濃度(0.3、3、10、30 μmol/L)的上升，其促進(jìn)增殖作用較AA模型組的軟骨細(xì)胞的增殖差異有顯著性(F=10.351,P<0.05，P<0.01)，見圖4。考慮低濃度(0.03 μmol/L)環(huán)巴胺對AA大鼠軟骨細(xì)胞增殖作用不明顯，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇環(huán)巴胺處理終濃度分別為0.3、3、10 μmol/L。

圖4 不同濃度環(huán)巴胺對AA大鼠軟骨細(xì)胞增殖的影響

2.4環(huán)巴胺對AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的影響培養(yǎng)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞在熒光顯微鏡下，通過Hoechst 33258染色后，可見AA模型組軟骨細(xì)胞有較多的細(xì)胞核出現(xiàn)碎裂和染色質(zhì)的固縮，呈現(xiàn)凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，見圖5A，環(huán)巴胺給藥組的AA大鼠軟骨細(xì)胞的凋亡較模型組減少，見圖5B～D，表明環(huán)巴胺有減少AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的作用。

圖5 環(huán)巴胺對AA大鼠軟骨細(xì)胞凋亡的影響 ×200

A：模型組；B：環(huán)巴胺(0.3 μmol/L)；C:環(huán)巴胺(3 μmol/L);D:環(huán)巴胺(10 μmol/L)

2.5環(huán)巴胺體外影響軟骨細(xì)胞中Hh通路相關(guān)蛋白的表達(dá)環(huán)巴胺(終濃度0、0.3、3、10 μmol/L)處理AA大鼠軟骨細(xì)胞24 h后，Western blot法檢測顯示，與AA模型大鼠軟骨細(xì)胞中Hh通路中相關(guān)蛋白比較，環(huán)巴胺處理組的Shh、Gli1、Ptch1蛋白表達(dá)水平呈一定程度的下降趨勢，見圖6A；與AA模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，見圖6B。

圖6 Western blot法檢測環(huán)巴胺影響軟骨細(xì)胞中Hh通路中相關(guān)蛋白

1：模型組；2：環(huán)巴胺(0.3 μmol/L)；3:環(huán)巴胺(3 μmol/L);4:環(huán)巴胺(10 μmol/L);與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

RA屬于自身免疫性疾病，主要原因?yàn)榛そM織增生，導(dǎo)致軟骨和骨進(jìn)行性破壞，病程遷延至患者關(guān)節(jié)功能障礙，甚至殘疾[1]。由FCA誘導(dǎo)的AA模型是經(jīng)典的探討RA機(jī)制的動物模型[5]，本研究中成功采用FCA大鼠足底皮下注射誘導(dǎo)SD大鼠，通常注射側(cè)足爪(原發(fā)側(cè))腫脹外，繼發(fā)側(cè)足爪于原發(fā)側(cè)10 d后有炎性反應(yīng)，本研究通過關(guān)節(jié)腫脹度評估繼發(fā)側(cè)足爪關(guān)節(jié)炎改變，研究結(jié)果表明，注射FCA 12 d后，SD大鼠繼發(fā)側(cè)關(guān)節(jié)腫脹明顯。HE染色表明注射FCA后，模型組大鼠較正常組踝關(guān)節(jié)滑膜組織增生，并侵襲關(guān)節(jié)軟骨中，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞形態(tài)改變，表明AA大鼠模型造模成功。軟骨組織主要由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成，覆蓋在關(guān)節(jié)表面，軟骨細(xì)胞在軟骨囊內(nèi)活躍增生和分裂，形成同源細(xì)胞群，是軟骨更新和修復(fù)中最重要的細(xì)胞[6]。在RA形成過程中，軟骨細(xì)胞正常的增殖和代謝發(fā)生改變，其異常的凋亡降低了軟骨密度，軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的軟骨基質(zhì)平衡紊亂，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨受損，嚴(yán)重影響關(guān)節(jié)的功能[7]。本研究免疫組化結(jié)果表明，軟骨細(xì)胞中產(chǎn)生基質(zhì)的重要組成成分II型膠原表達(dá)陽性；甲苯胺藍(lán)染色，軟骨細(xì)胞的胞質(zhì)淺藍(lán)色，證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞為AA大鼠的軟骨細(xì)胞。

在臨床上，RA的治療主要是對癥和抗炎處理，特異性治療藥物尚缺乏，異甾體類生物堿環(huán)巴胺是從藜蘆屬植物中分離提取，具有抑制腫瘤生長功能[4]，而RA發(fā)病中，滑膜細(xì)胞異常增殖呈類腫瘤樣生長的特性，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞增殖出現(xiàn)異常[5]。本研究中先采用CCK-8法檢測了軟骨細(xì)胞增殖情況，然后通過環(huán)巴胺體外給藥觀察AA大鼠軟骨細(xì)胞增殖情況，研究表明，隨著環(huán)巴胺濃度的升高，AA模型大鼠軟骨細(xì)胞增殖隨之增加。為探討該現(xiàn)象，該實(shí)驗(yàn)觀察了環(huán)巴胺對軟骨細(xì)胞的凋亡作用，Hoechst 33258能穿透細(xì)胞膜，為藍(lán)色非嵌入型的熒光染料，可與細(xì)胞中DNA聚AT序列結(jié)合，在熒光顯微鏡紫外光激發(fā)時呈亮藍(lán)色熒光，細(xì)胞凋亡時，DNA斷裂，呈核碎裂和染色質(zhì)固縮，故可通過Hoechst 33258染料進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測[8]。該研究中通過Hoechst 33258染色后，AA模型組軟骨細(xì)胞有較多的核碎裂和染色質(zhì)固縮的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，環(huán)巴胺給藥組細(xì)胞凋亡減少。故環(huán)巴胺提高軟骨細(xì)胞增殖可能與其抑制AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡作用有關(guān)。

骨關(guān)節(jié)炎中，存在活化的Hedgehog(Hh)信號通路參與骨和關(guān)節(jié)破壞[9]。Hh信號通路包含以下幾個過程[10]：首先是Hh信號分子Dhh、Shh、Ihh等通過跨膜受體Smo、Ptch，激活轉(zhuǎn)錄因子Glis家族，活化的轉(zhuǎn)錄因子Glis家族進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，最后通過下游靶基因發(fā)揮功能。RA時，Hh蛋白結(jié)合Ptch蛋白，降低了Ptch蛋白對Smo的抑制作用，導(dǎo)致下游核轉(zhuǎn)錄因子Glis家族激活，靶基因表達(dá)增加，加劇RA病情。Hh信號通路的異常激活在骨關(guān)節(jié)病中的研究廣受關(guān)注，可調(diào)節(jié)骨與軟骨生長與發(fā)育[11]。本研究Western blot結(jié)果表明，未給予環(huán)巴胺的AA模型大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中Hh蛋白表達(dá)水平較高，存在Hh信號通路蛋白異常激活現(xiàn)象；在環(huán)巴胺作用AA大鼠軟骨細(xì)胞24 h后，Hh信號通路蛋白Shh蛋白、Ptch1蛋白、Gli1蛋白水平表達(dá)明顯下降，表明環(huán)巴胺體外給藥可顯著下降A(chǔ)A大鼠軟骨細(xì)胞中Hh信號通路蛋白的表達(dá)，抑制其過度活化，這可能進(jìn)一步說明環(huán)巴胺處理后，AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖修復(fù)，較骨細(xì)胞凋亡減少。

綜上，本研究表明，Hh通路抑制劑環(huán)巴胺可糾正紊亂的AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖，抑制關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡，提示干預(yù)AA大鼠軟骨細(xì)胞Hh信號通路，有可能保護(hù)RA關(guān)節(jié)潛在的應(yīng)用價值。

(致謝：感謝安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院李榮博士在實(shí)驗(yàn)中給予的幫助。)

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