miR-133b通過(guò)靶向調(diào)控EGFR影響食管鱗癌的侵襲、轉(zhuǎn)移

曾 薇， 朱金峰，孔德華，單 莉

食管鱗癌的侵襲、轉(zhuǎn)移是多因素的綜合作用，是多基因變化積累、疊加的結(jié)果。隨著miRNA的生成及功能異常在多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用被逐漸認(rèn)識(shí)[1]，miRNA在食管鱗癌侵襲、轉(zhuǎn)移中的機(jī)制研究越來(lái)越受到人們的關(guān)注[2]。miRNA長(zhǎng)約20～24 nt，主要通過(guò)轉(zhuǎn)錄后或翻譯水平調(diào)控基因表達(dá)[3]。目前研究[4]顯示，在食管鱗癌組織中低表達(dá)的miR-133b可能作為抑癌基因，參與食管鱗癌的演進(jìn)，并預(yù)測(cè) miR-133b 可能作為食管鱗癌治療的潛在靶點(diǎn)。該研究將對(duì)miR-133b參與食管鱗癌侵襲、轉(zhuǎn)移的具體作用及機(jī)制做進(jìn)一步的研究討論。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞系 人食管鱗癌細(xì)胞系ECA109、KYSE150購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)。所有細(xì)胞為90% RPMI 1640培養(yǎng)基加10%胎牛血清，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。DMEM 培養(yǎng)基用于Transwell 實(shí)驗(yàn)。

1.1.2組織標(biāo)本 收集2008年1月～2010年12月新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸外科手術(shù)切除的食管鱗癌組織標(biāo)本，包括腫瘤及與其配對(duì)的正常食管黏膜組織。所有患者術(shù)前未接受化療、放療或其他任何相關(guān)的抗腫瘤治療。根據(jù)UICC TNM (第七版)分期。所有臨床標(biāo)本經(jīng)過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科專(zhuān)家診斷證實(shí)。臨床標(biāo)本的切取均通過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并征得患者的同意簽署知情同意書(shū)。

1.2方法

1.2.1運(yùn)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miR-133b的靶基因 運(yùn)用MiRbase、Targetscans及PicTar數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè) miR-133b的候選靶基因。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d，細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)70%～80%。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，使用250 μl無(wú)血清Opti-MEM I培養(yǎng)基稀釋miR-133b mimic/negative control 4.0 μg，輕輕混勻，室溫下靜置5 min。同時(shí)將LipofectamineTM2000 10 μl稀釋于250 μl無(wú)血清Opti-MEM I培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫下靜置5 min。分別混合LipofectamineTM2000和miR-133b mimic/miR-133b negative control的稀釋液，室溫下靜置20 min。6孔板的每個(gè)孔中加入混合液500 μl。4 h后更換細(xì)胞培養(yǎng)液，于37 ℃、CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用于后續(xù)檢測(cè)。

1.2.3熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR) 查找基因序列，設(shè)計(jì)引物，見(jiàn)表1。引物由上海生工合成。使用ABI7500型定量PCR儀。TRIzol法提取組織RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系10 μl為：5×PrimerScript RT Master Mix 2 μl、總RNA 500 ng、加無(wú)RNase酶的水至10 μl。反應(yīng)條件為：37 ℃、15 min；85 ℃、5 s；4 ℃、5 min。qRT-PCR反應(yīng)體系10 μl為：SYBR Premix Ex TaqII(2×)5 μl，上/下游引物各0.5 μl，cDNA 2 μl，RNase Free dH2O 2 μl。反應(yīng)條件為：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s；60 ℃、30 s。每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt法計(jì)算。

表1 qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)引物序列

1.2.4Western blot 收集細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，SDS-PAGE膠電泳，將蛋白電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%BSA封閉，一抗(1 ∶500)4 ℃孵育過(guò)夜，二抗(1 ∶1 000)室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯像。

1.2.5熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞按70%的密度接種至96孔板。按比例配制報(bào)告基因質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑即Firefly:Renilla:轉(zhuǎn)染試劑=0.1 μg:0.01 μg:0.25 μl，并常溫下孵育5 min。配制miR-133b mimic/negative control和轉(zhuǎn)染試劑的稀釋液：加入轉(zhuǎn)染試劑0.25 μl使miR-133b mimic/negative control的終濃度為100 nmol/L，常溫孵育5 min。將稀釋好的報(bào)告基因質(zhì)粒、miR-133b mimic/negative control混勻，常溫孵育20 min，然后分別添加到每孔細(xì)胞樣品中。轉(zhuǎn)染6 h后，更換細(xì)胞培養(yǎng)基。48 h后棄去培養(yǎng)基，用100 μl 1×PBS洗1遍。每孔加50 μl稀釋好的 1×PLB，置于搖床上，常溫下15 min進(jìn)行裂解。在白色不透光的96孔酶標(biāo)板中每孔加入裂解液的上清液10 μl， 再加入100 μl預(yù)先混好的LAR Ⅱ，2 s后測(cè)數(shù)據(jù)，得到螢火蟲(chóng)熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度。每孔再添加100 μl預(yù)先混好的Stop&Glo Reagent，靜止2 s后測(cè)數(shù)據(jù)，得到內(nèi)參海腎熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度。

1.2.6細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 接種2×105個(gè)細(xì)胞至96孔板，48 h后加入新鮮配置的MTT溶液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)，每孔加入150 μl二甲基亞砜，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處測(cè)量各孔的光密度(optical density,OD)值。

1.2.7細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 接種2×106個(gè)細(xì)胞至6孔板，待細(xì)胞完全融合后垂直劃出等寬的細(xì)胞劃痕，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，并于相應(yīng)時(shí)間段在顯微鏡下觀察劃痕寬度，同時(shí)拍照記錄。

1.2.8Transwell 實(shí)驗(yàn) ECA109、KYSE150細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后(具體轉(zhuǎn)染步驟詳見(jiàn)方法1.2.2)，胰酶消化并制備單細(xì)胞懸液，以5×104個(gè)細(xì)胞密度接種于Transwell小室，24孔板下層加入750 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，70 h后計(jì)算細(xì)胞過(guò)膜率。

2 結(jié)果

2.1生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)miR-133b的靶基因本研究主要探索miR-133b調(diào)控其靶基因參與食管鱗癌侵襲、轉(zhuǎn)移的機(jī)制。表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)所參與的信號(hào)通路，與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。故本研究鎖定在3個(gè)miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)中miR-133b靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果的交集-EGFR，作為miR-133b的預(yù)測(cè)靶基因進(jìn)行下一步的研究。見(jiàn)表2。

表2 miR-133b與靶基因EGFR的結(jié)合序列

2.2雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-133b的靶基因?yàn)樽C實(shí)miR-133b對(duì)其靶基因EGFR的調(diào)控作用，課題組構(gòu)建了EGFR野生型及突變型質(zhì)粒進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。具體實(shí)驗(yàn)分組如下：MT組即插入了EGFR突變型質(zhì)粒3′UTR片段的螢光素酶報(bào)告基因載體，WT組即插入了EGFR野生型質(zhì)粒 3′UTR片段的螢光素酶報(bào)告基因載體，NC組即螢光素酶報(bào)告基因載體。在食管鱗癌細(xì)胞ECA109、KYSE150中，通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-133b mimics，檢測(cè)各組的熒光素酶活性，判斷miR-133b對(duì)EGFR的調(diào)控作用。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miR-133b mimics對(duì)MT組和NC組的熒光素酶活性影響不顯著，但能使WT組的螢光素酶活性明顯下降(ECA109:t=20.24vsNC組，P<0.01，KYSE150:t=14.07vsNC組，P<0.01)，提示miR-133b可直接靶向調(diào)控EGFR，見(jiàn)圖1。

圖1 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-133bmimics對(duì)各實(shí)驗(yàn)組熒光素酶活性的影響

2.3miR-133b對(duì)食管鱗癌細(xì)胞中EGFR表達(dá)的影響采用qRT-PCR、Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-133b對(duì)EGFR表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)分組如下：miR-133b mimics組即在食管鱗癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-133b mimics；negative control組即在食管鱗癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染negative control。qRT-PCR結(jié)果顯示，在食管鱗癌細(xì)胞ECA109、KYSE150中，與negative control組相比，miR-133b mimics組中miR-133b在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)顯著上調(diào)，提示轉(zhuǎn)染有效(ECA109:t=9.28vsnegative control組，P<0.01； KYSE150:t=35.53vsnegative control組，P<0.01)。但與negative control組相比，miR-133b mimic組中EGFR在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)無(wú)顯著變化，見(jiàn)圖2A～D。Western blot結(jié)果顯示，在食管鱗癌細(xì)胞ECA109、KYSE150中，與negative control組相比，miR-133b mimics組中EGFR在蛋白水平的表達(dá)發(fā)生顯著下調(diào)，見(jiàn)圖2E。

2.4miR-133b抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-133b對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)分組同2.3中描述。結(jié)果顯示，在食管鱗癌細(xì)胞ECA109、KYSE150中，與negative control組相比，72 h時(shí)miR-133b mimics組細(xì)胞的增殖能力顯著下降(ECA109:t=4.18vsnegative control組，P<0.05，KYSE150:t=11.18vsnegative control組，P<0.01)，提示miR-133b 能夠抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖，對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)起抑制作用，見(jiàn)圖3。

2.5miR-133b抑制食管鱗癌細(xì)胞遷移采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-133b對(duì)食管鱗癌細(xì)胞遷移能力的影響。實(shí)驗(yàn)分組同2.3中描述。結(jié)果顯示，在食管鱗癌細(xì)胞ECA109中，negative control組、miR-133b mimics組細(xì)胞劃痕閉合率分別為(42.00%±4.36%)、(14.00%±4.58%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.67vsnegative control組，P<0.01)；食管鱗癌細(xì)胞KYSE150中，negative control組、miR-133b mimics組細(xì)胞劃痕閉合率分別為(52.33%±5.86%)、(22.00%±4.36%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.19vsnegative control組，P<0.01)；上述實(shí)驗(yàn)提示，上調(diào)miR-133b表達(dá)可以抑制兩種食管鱗癌細(xì)胞的遷移，見(jiàn)圖4。

2.6miR-133b抑制食管鱗癌細(xì)胞侵襲采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-133b對(duì)食管鱗癌細(xì)胞侵襲能力的影響。實(shí)驗(yàn)分組同2.3中描述。結(jié)果顯示，在食管鱗癌細(xì)胞ECA109中，negative control組、miR-133b mimics組細(xì)胞過(guò)膜數(shù)分別為(78.67±7.02)、(19.67±3.06)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.02vsnegative control組，P<0.01)；在食管鱗癌細(xì)胞KYSE150中，negative control組、miR-133b mimics組細(xì)胞過(guò)膜數(shù)分別為(87.33±5.77)、(24.67±7.37)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.59vsnegative control組，P<0.01)；上述實(shí)驗(yàn)提示，上調(diào)miR-133b表達(dá)對(duì)兩種食管鱗癌細(xì)胞的侵襲能力具有抑制作用，見(jiàn)圖5。

2.7miR-133b及EGFR在食管鱗癌組織中的表達(dá)采用qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-133b與EGFR在33例食管鱗癌組織中的表達(dá)，并進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，miR-133b在食管鱗癌組織中的表達(dá)下調(diào)，EGFR在食管鱗癌組織中的表達(dá)上調(diào)，二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性(P<0.01)，見(jiàn)圖6。將miR-133b的表達(dá)與食管鱗癌患者的臨床病理特征進(jìn)行相關(guān)性分析顯示：miR-133b的表達(dá)與腫瘤的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，即miR-133b在Ⅰ/Ⅱ期食管鱗癌中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于Ⅲ期 (P<0.05)、miR-133b在淋巴結(jié)陰性食管鱗癌中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于淋巴結(jié)陽(yáng)性食管鱗癌(P<0.05)，見(jiàn)表3。

圖2 miR-133b對(duì)EGFR在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平表達(dá)的影響

A：ECA109細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-133b mimics 檢測(cè)miR-133b轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)；B：KYSE150細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-133b mimics 檢測(cè)miR-133b轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)；C：ECA109細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-133b mimics 檢測(cè)EGFR轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)；D：KYSE150細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-133b mimics 檢測(cè)EGFR轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)；E：ECA109、KYSE150細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-133b mimics 檢測(cè)EGFR蛋白水平的表達(dá)；與negative control組比較：*P<0.05

圖3 miR-133b對(duì)兩種食管鱗癌細(xì)胞增殖的影響

圖4 miR-133b對(duì)兩種食管鱗癌細(xì)胞遷移能力的影響 ×200

圖5 miR-133b對(duì)兩種食管鱗癌細(xì)胞侵襲能力的影響 ×200

A：ECA109 negative control組；B：ECA109 miR-133b mimics組；C：KYSE150 negative control組；D：KYSE150 miR-133b mimics組；與negative control組比較：*P<0.05

表3 miR-133b表達(dá)與食管鱗癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

圖6 食管鱗癌組織中miR-133b與EGFR的表達(dá)及相關(guān)性分析

食管癌位居全球惡性腫瘤發(fā)病率的前列[5]。中國(guó)是食管癌的高發(fā)區(qū)。Chen et al[6]2016年的統(tǒng)計(jì)分析指出，中國(guó)食管癌的發(fā)病率為477 900例，接近全球食管癌發(fā)病的50%。其中食管鱗癌占食管癌發(fā)病的90%以上，其惡性程度高，預(yù)后差，多數(shù)食管鱗癌在確診時(shí)即分期較晚，喪失手術(shù)機(jī)會(huì)，并且一些食管鱗癌在早期既有較強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移趨勢(shì)[7]。 在過(guò)去的幾十年中，隨著外科技術(shù)的提高以及新輔助化放療技術(shù)的運(yùn)用，食管鱗癌患者的預(yù)后有了一定程度的改善，但患者的5年生存率仍然較低[8]。

如果能尋找到與食管鱗癌侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子生物學(xué)標(biāo)志物，在食管鱗癌患者中發(fā)現(xiàn)侵襲、轉(zhuǎn)移的高危人群并進(jìn)行有針對(duì)性的治療，將有望改善食管鱗癌患者的預(yù)后[9]。

目前越來(lái)越多的證據(jù)顯示，miRNA的異常表達(dá)在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[10]。Fu et al[4]研究發(fā)現(xiàn)miR-133b在食管鱗癌中呈低表達(dá)，且miR-133b的差異表達(dá)與食管鱗癌的侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)。Kano et al[11]發(fā)現(xiàn)在食管鱗癌細(xì)胞中上調(diào)miR-133b，可以抑制細(xì)胞增殖、阻止腫瘤細(xì)胞侵襲，提示miR-133b可能作為抑癌基因參與食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展。Qin et al[12]研究發(fā)現(xiàn)，miR-133b在食管鱗癌組織和細(xì)胞中均呈低表達(dá)，上調(diào)食管鱗癌細(xì)胞中miR-133b的表達(dá)，可對(duì)食管鱗癌的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化起負(fù)調(diào)控作用，提示miR-133b在食管鱗癌的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。

EGFR屬于ErbB受體家族。研究[13]顯示，在多種實(shí)體瘤中，EGFR的過(guò)表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡以及血管生成有關(guān)，而EGFR基因的突變則有助于上皮細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。Jia et al[14]研究發(fā)現(xiàn)，在食管鱗癌組織中高表達(dá)的EGFR與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度及TNM分期呈正相關(guān)。COX回歸分析顯示，EGFR可作為食管鱗癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。Wang et al[15]采用免疫組化法對(duì)癌前病變、早期食管鱗癌、進(jìn)展期食管鱗癌組織中EGFR的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，EGFR的陽(yáng)性表達(dá)率隨腫瘤的進(jìn)展而增高。提示EGFR可能參與了食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。Lin et al[16]研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的EGFR與腫瘤較差的分化程度相關(guān)，而EGFR的擴(kuò)增則與腫瘤的分期、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移相關(guān)，并提示EGFR的拷貝數(shù)增加可作為食管鱗癌預(yù)后判定的指標(biāo)。

關(guān)于miR-133b和EGFR在腫瘤中的表達(dá)調(diào)控關(guān)系，目前已有一些研究報(bào)道。Liu et al[17]研究發(fā)現(xiàn)，miR-133b可通過(guò)調(diào)控EGFR表達(dá)，影響其下游通路的活化，從而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提高EGFR-TKI藥物治療的敏感性。Tao et al[18]研究發(fā)現(xiàn)，在激素治療不敏感的PC3 和DU145前列腺癌細(xì)胞中，miR-133b可通過(guò)調(diào)控EGFR表達(dá)，影響細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移。但目前對(duì)于食管鱗癌中miR-133b與EGFR之間的靶向調(diào)控關(guān)系，尚無(wú)研究報(bào)道。而本研究則對(duì)這一調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了初步的探索和驗(yàn)證。在本研究中，課題組通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)EGFR為miR-133b的下游靶基因，并采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)證實(shí)miR-133b可直接靶向作用于EGFR。在食管鱗癌細(xì)胞中證實(shí)通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-133b mimic，上調(diào)miR-133b的表達(dá)，可以下調(diào)EGFR在蛋白水平的表達(dá)，并抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移。在食管鱗癌組織中采用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-133b呈低表達(dá)，EGFR呈高表達(dá)，且二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。將miR-133b的表達(dá)與食管鱗癌的臨床病理特征進(jìn)行相關(guān)性分析顯示，miR-133b的表達(dá)與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。基于上述研究結(jié)果，課題組推測(cè)在正常食管黏膜組織中miR-133b可能通過(guò)與其靶基因EGFR的3′-UTR端結(jié)合，通過(guò)維持EGFR在蛋白水平的正常表達(dá)，從而使正常食管黏膜組織細(xì)胞的增殖與凋亡處于動(dòng)態(tài)平衡。而在食管鱗癌組織中，由于某種或多種原因?qū)е碌膍iR-133b的生成及功能異常，致使miR-133b的表達(dá)下調(diào)、miR-133b對(duì)EGFR表達(dá)的調(diào)控作用減弱，使EGFR在蛋白水平的表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖過(guò)度，細(xì)胞的侵襲及遷移能力增強(qiáng)，從而促進(jìn)了腫瘤的進(jìn)展。

但是，目前對(duì)于miR-133b的上游調(diào)控機(jī)制，miR-133b靶向調(diào)控EGFR參與食管鱗癌的侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程的具體信號(hào)通路、以及下調(diào)食管鱗癌中EGFR的表達(dá)對(duì)miR-133b表達(dá)及食管鱗癌侵襲、轉(zhuǎn)移的影響，目前尚不完全清楚，在今后的實(shí)驗(yàn)中課題組將針對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行進(jìn)一步的探討。

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