膽管癌中GPR120蛋白的表達及其臨床意義

孟府陶，黃 強，劉臣海，黃 玫

膽管癌(cholangiocarcinoma，CCA)是起源于膽道樹上不同位置的上皮細胞惡性腫瘤，是消化道惡性疾病中侵襲性極高、預后極差的腫瘤之一[1]。由于常規放化療對改善長期生存作用有限，根治性手術目前仍是CCA患者獲得長期生存的唯一機會。不幸的是，由于嚴重的侵襲轉移，許多患者在被診斷為CCA時已錯過根治性手術的最佳時機[1-3]。所以，為了提高CCA患者的早期診斷，必須更深入的研究CCA的進展機制。G蛋白偶聯受體(G-protein couple receptors, GPCRs)表達不受控制和GPCRs信號傳導失調是腫瘤的生物學特性之一[4]。GPR120是體內重要的G蛋白偶聯受體之一，近年來發現GPR120在很多惡性腫瘤中異常表達，且與腫瘤的發生、發展及侵襲轉移有關[5]。然而，GPR120在CCA中的表達以及在CCA進展中的作用國內外鮮有研究。該研究主要通過免疫組織化學法檢測GPR120在人CCA中的表達情況，并分析其在CCA進展中及生存預后的關系。

1 材料與方法

1.1病例資料本研究選取安徽醫科大學附屬安徽省立醫院2010年1月～2015年1月經病理診斷確診的60例CCA患者的腫瘤組織石蠟切片作為實驗組，選擇其中20例可獲得癌旁組織的石蠟切片作為對照組。所有患者接受了根治性手術切除，病理診斷為CCA。手術前均未接受化療或放射治療。石蠟包埋的組織樣本，包括腫瘤組織標本及其相應的癌旁組織標本，均從病理科獲得，超過腫瘤邊緣2 cm的CCA組織被定義為癌旁組織。回顧性病史獲得的臨床病理資料包括年齡、性別、腫瘤位置、組織學分級、淋巴結轉移(LNM)、神經周圍浸潤(PNI)，腫瘤TNM分期。其中男39例，女21例；年齡36～80歲，中位年齡在66歲。上段膽管癌(肝門部膽管癌)24例，中下段膽管癌36例。經病理檢查證實屬高分化腺癌16例，中分化腺癌32例，低分化腺癌12例，手術中探查及切除標本術后病理切片證實無癌周及遠處淋巴結轉移者41例，已發生轉移者19例，轉移的部位為淋巴結、肝臟、胰腺、大網膜、肝十二指腸韌帶。有神經浸潤的23例，無神經浸潤的37例。TNM分期依照2010年美國癌癥聯合委員會(AJCC)制定的第七版TNM分期標準，T1-T2期37例，T3-T4期23例。

1.2試劑與方法

1.2.1主要試劑 GPR120兔抗人多克隆抗體(稀釋比1 ∶100)購自美國Abcam生物公司；SP試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2.2實驗方法 采用免疫組化SP法，以PBS代替一抗作陰性對照。操作步驟: ① 石蠟包埋,4 μm

連續切片后置于載玻片上，在60 ℃烤箱中加熱20 min脫蠟，經二甲苯脫水，分級濃度乙醇(分別為100%、95%、75%)水化，再經PBS溶液漂洗；② 切片放入檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中，同容器一起放入高壓鍋中加熱煮沸，蓋上壓力氣閥至噴氣后持續5 min;③ 通過3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶活性,阻斷時間為10 min，PBS沖洗3次，每次3 min;④ 將1 ∶100濃度稀釋的GPR120兔多克隆抗體,加入后，4 ℃孵育過夜。PBS沖洗3次，每次3 min;⑤ 顯微鏡控制下進行DAB顯色;⑥ 最后，使用蘇木精復染，酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片，鏡檢并照相記錄。此外，對于陰性對照組，在相同條件下用PBS替代主要抗體。

1.3免疫組織化學結果分析結果判定：GPR120蛋白主要定位于膽管癌細胞膜和細胞質中，在膽管癌細胞核周圍出現彌漫性棕黃色或黃色，而在腫瘤間質細胞中染色相對較少。評價免疫組化結果的方法是按陽性細胞百分比評分: 隨機選擇5個400倍視野，每個視野計數100個細胞，高于60%細胞陽性計3分，31%～60%計2分，11%～30% 計1分，低于10%計0分;按染色強弱等級評分:未著色計0分，淡黃色計1分，黃色計2分，棕黃色計3分，由同一位病理科醫師評價統計完成，每張切片2項得分總計>3分即認定為GPR120陽性表達[6]。

1.4隨訪以電話隨訪的形式對60例CCA患者均進行了隨訪，隨訪終止時間為發生事件或患者因疾病死亡或隨訪截止日，其中失訪7例,隨訪率為88.3%。使用Kaplan-Meier法繪制患者生存曲線，分析GPR120在膽管癌組織中的表達與預后的關系。

1.5統計學處理采用SPSS 17.0軟件進行分析。分類變量通過χ2檢驗或精確概率算法檢驗；通過Kaplan-Meier法繪制生存曲線，兩組比較通過Log-Rank檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1GPR120蛋白在膽管癌及癌旁正常膽管組織中的表達GPR120主要定位于膽管癌細胞膜和細胞質中，陽性表達定義為胞質內有黃色或棕黃色顆粒，而間質細胞無染色情況。60例膽管癌組織中，GPR120陽性表達率為68.3%(41/60)；20例癌旁正常膽管組織中，GPR120陽性表達率為25%(5/20)，見圖1。經過統計分析表明，正常膽管組織中的陽性表達比例明顯低于GPR120在膽管癌中的陽性表達，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2膽管癌組織中GPR120表達與臨床病理特征的關系GPR120的表達與CCA的病理分化等級、神經是否浸潤、淋巴有無轉移、TNM分期有關(P<0.05)。在病理中低分化組(34/44) 中表達明顯高于病理高分化組(7/16)、神經浸潤組(20/23)中表達明顯高于無神經浸潤組(21/37)，淋巴結轉移組(17/19)中表達亦明顯高于無轉移組(24/41)，差異有統計學意義(P<0.05)。但與患者的年齡、性別、腫瘤所處位置并無顯著相關性。見表2。

圖1 膽管癌組織與癌旁正常膽管組織中GPR120的表達

A:膽管癌組織；B:癌旁正常膽管組織；1:SP×100;2:SP×200;3:SP×400

表1 GPR120蛋白在膽管癌組織和癌旁正常膽管組織中的表達(n)

2.3GPR120的表達與膽管癌患者生存期的關系60例CCA患者中GPR120陽性表達者41例，陰性表達者19例，失訪7例患者(其中4例失訪者為GPR120陽性表達者，3例為GPR 120陰性表達者)。Kaplan-Meier生存分析顯示陽性表達者的中位生存期為27個月，陰性表達者的中位生存期40個月，經Log-Rank檢驗顯示，GPR120蛋白表達陽性患者組與陰性患者組生存率比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

表2 膽管癌組織中GPR120蛋白的表達與臨床病理關系(n)

圖2 膽管癌中GPR120陽性患者、陰性患者的生存曲線

3 討論

GPR120是近年來發現的一個具有重要功能的G蛋白偶聯受體，屬于進化保守的視紫紅質家族受體，目前的研究[5]表明，飽和與不飽和的長鏈游離脂肪酸(LCFAs)通過激活GPR120受體參與調節一系列的代謝過程，如激素分泌、細胞增殖及脂質生成等。GPR120在脂質代謝平衡中起到了至關重要的作用。近年來由于對GPR120研究熱度和深度的增加，越來越多的文獻報道表明，GPR120也在腫瘤發生、遷移和轉移發生中發揮重要作用[4]。在消化系統腫瘤中，研究[6-7]顯示GPR120在結直腸癌和胰腺癌細胞中表達顯著增高，并對腫瘤細胞的增殖、遷移等能力起著明顯的上調效應作用。研究[6]表明，GPR120作為一個人類結直腸癌中的腫瘤促進受體，在被配體刺激后，GPR120作為PI3K/Akt-NF-κB信號通路傳導過程中的重要環節通過介導調節促血管生成因子白介素-8(IL-8)、血管內皮生長因子(VEGF)和環氧合酶-2(COX-2)衍生的前列腺素E2(PGE2)，促進血管生成。同時也發現GPR120的激活促進結直腸癌細胞(CRC)遷移和誘導上皮間充質化(EMT)。這一發現提供了GPR120在人體中發揮作用機制的新思路，將最近的脂質組學與癌癥的發展聯系起來[6]。但是，GPR120在黑色素瘤中有著不同的作用效應。研究[8]表明通過具有皮膚致癌作用的腫瘤促進劑12-O-十四酰基糠醇-13-乙酸酯(TPA)長期刺激，在黑素瘤細胞中，GPR120負性調節可以促進黑素瘤細胞遷移侵襲活性增強。以上研究說明GPR120在不同腫瘤中發揮的作用似乎各不相同。

本團隊在GPR120研究的現有基礎之上，初步探討分析了GPR120在CCA組織以及癌旁正常膽管組織中的表達情況，是否存在差異性表達，是否與臨床病理相關特征具有密切相關性。研究結果顯示GPR120在CCA中的表達與癌旁正常膽管黏膜上皮組織有差異，同樣與膽管癌組織的分化程度、TNM分期、淋巴轉移、神經侵犯等病理相關因素有密切關系，提示GPR120蛋白可能在CCA的發生發展和生物學行為中起到正性上調作用。另外，本研究顯示GPR120陽性表達患者的中位生存期為27個月，陰性表達患者的中位生存期為40個月，Kaplan-Meier 生存曲線及Log-Rank檢驗提示兩組間中位生存期差異有統計學意義，亦說明GPR120蛋白可能具有作為膽管癌預后獨立因素的潛力。必須承認的是，本研究是一個典型的單一回顧性研究，且研究樣本相對較小，是從較淺層面上檢測觀察GPR120在CCA中的表達狀態高于正常膽管組織，提示GPR120蛋白的過表達可能與CCA的惡性程度有關，但其促進膽管癌細胞侵襲和轉移的潛在機制目前尚不清楚，需擴大樣本量進一步證實，并在細胞學、動物實驗水平進行驗證，并對其具體作用機制進行探索。

總之，CCA作為一種惡性程度高、侵襲轉移能力強的消化道腫瘤，常常發現時已是晚期，生活質量較差，且生存時間短，而作為一個新興發現的重要G蛋白偶聯受體，GPR120在CCA發生發展中可能起到促癌作用，并有希望成為膽管癌早期診斷的一個生物標志物和臨床藥物研發治療的新靶點。

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