膽管癌中GPR120蛋白的表達及其臨床意義

孟府陶，黃 強，劉臣海，黃 玫

膽管癌(cholangiocarcinoma，CCA)是起源于膽道樹上不同位置的上皮細(xì)胞惡性腫瘤，是消化道惡性疾病中侵襲性極高、預(yù)后極差的腫瘤之一[1]。由于常規(guī)放化療對改善長期生存作用有限，根治性手術(shù)目前仍是CCA患者獲得長期生存的唯一機會。不幸的是，由于嚴(yán)重的侵襲轉(zhuǎn)移，許多患者在被診斷為CCA時已錯過根治性手術(shù)的最佳時機[1-3]。所以，為了提高CCA患者的早期診斷，必須更深入的研究CCA的進展機制。G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein couple receptors, GPCRs)表達不受控制和GPCRs信號傳導(dǎo)失調(diào)是腫瘤的生物學(xué)特性之一[4]。GPR120是體內(nèi)重要的G蛋白偶聯(lián)受體之一，近年來發(fā)現(xiàn)GPR120在很多惡性腫瘤中異常表達，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)[5]。然而，GPR120在CCA中的表達以及在CCA進展中的作用國內(nèi)外鮮有研究。該研究主要通過免疫組織化學(xué)法檢測GPR120在人CCA中的表達情況，并分析其在CCA進展中及生存預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1病例資料本研究選取安徽醫(yī)科大學(xué)附屬安徽省立醫(yī)院2010年1月～2015年1月經(jīng)病理診斷確診的60例CCA患者的腫瘤組織石蠟切片作為實驗組，選擇其中20例可獲得癌旁組織的石蠟切片作為對照組。所有患者接受了根治性手術(shù)切除，病理診斷為CCA。手術(shù)前均未接受化療或放射治療。石蠟包埋的組織樣本，包括腫瘤組織標(biāo)本及其相應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本，均從病理科獲得，超過腫瘤邊緣2 cm的CCA組織被定義為癌旁組織。回顧性病史獲得的臨床病理資料包括年齡、性別、腫瘤位置、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(LNM)、神經(jīng)周圍浸潤(PNI)，腫瘤TNM分期。其中男39例，女21例；年齡36～80歲，中位年齡在66歲。上段膽管癌(肝門部膽管癌)24例，中下段膽管癌36例。經(jīng)病理檢查證實屬高分化腺癌16例，中分化腺癌32例，低分化腺癌12例，手術(shù)中探查及切除標(biāo)本術(shù)后病理切片證實無癌周及遠處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者41例，已發(fā)生轉(zhuǎn)移者19例，轉(zhuǎn)移的部位為淋巴結(jié)、肝臟、胰腺、大網(wǎng)膜、肝十二指腸韌帶。有神經(jīng)浸潤的23例，無神經(jīng)浸潤的37例。TNM分期依照2010年美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)制定的第七版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，T1-T2期37例，T3-T4期23例。

1.2試劑與方法

1.2.1主要試劑 GPR120兔抗人多克隆抗體(稀釋比1 ∶100)購自美國Abcam生物公司；SP試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.2實驗方法 采用免疫組化SP法，以PBS代替一抗作陰性對照。操作步驟: ① 石蠟包埋,4 μm

連續(xù)切片后置于載玻片上，在60 ℃烤箱中加熱20 min脫蠟，經(jīng)二甲苯脫水，分級濃度乙醇(分別為100%、95%、75%)水化，再經(jīng)PBS溶液漂洗；② 切片放入檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中，同容器一起放入高壓鍋中加熱煮沸，蓋上壓力氣閥至噴氣后持續(xù)5 min;③ 通過3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性,阻斷時間為10 min，PBS沖洗3次，每次3 min;④ 將1 ∶100濃度稀釋的GPR120兔多克隆抗體,加入后，4 ℃孵育過夜。PBS沖洗3次，每次3 min;⑤ 顯微鏡控制下進行DAB顯色;⑥ 最后，使用蘇木精復(fù)染，酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片，鏡檢并照相記錄。此外，對于陰性對照組，在相同條件下用PBS替代主要抗體。

1.3免疫組織化學(xué)結(jié)果分析結(jié)果判定：GPR120蛋白主要定位于膽管癌細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，在膽管癌細(xì)胞核周圍出現(xiàn)彌漫性棕黃色或黃色，而在腫瘤間質(zhì)細(xì)胞中染色相對較少。評價免疫組化結(jié)果的方法是按陽性細(xì)胞百分比評分: 隨機選擇5個400倍視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，高于60%細(xì)胞陽性計3分，31%～60%計2分，11%～30% 計1分，低于10%計0分;按染色強弱等級評分:未著色計0分，淡黃色計1分，黃色計2分，棕黃色計3分，由同一位病理科醫(yī)師評價統(tǒng)計完成，每張切片2項得分總計>3分即認(rèn)定為GPR120陽性表達[6]。

1.4隨訪以電話隨訪的形式對60例CCA患者均進行了隨訪，隨訪終止時間為發(fā)生事件或患者因疾病死亡或隨訪截止日，其中失訪7例,隨訪率為88.3%。使用Kaplan-Meier法繪制患者生存曲線，分析GPR120在膽管癌組織中的表達與預(yù)后的關(guān)系。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0軟件進行分析。分類變量通過χ2檢驗或精確概率算法檢驗；通過Kaplan-Meier法繪制生存曲線，兩組比較通過Log-Rank檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1GPR120蛋白在膽管癌及癌旁正常膽管組織中的表達GPR120主要定位于膽管癌細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，陽性表達定義為胞質(zhì)內(nèi)有黃色或棕黃色顆粒，而間質(zhì)細(xì)胞無染色情況。60例膽管癌組織中，GPR120陽性表達率為68.3%(41/60)；20例癌旁正常膽管組織中，GPR120陽性表達率為25%(5/20)，見圖1。經(jīng)過統(tǒng)計分析表明，正常膽管組織中的陽性表達比例明顯低于GPR120在膽管癌中的陽性表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2膽管癌組織中GPR120表達與臨床病理特征的關(guān)系GPR120的表達與CCA的病理分化等級、神經(jīng)是否浸潤、淋巴有無轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)(P<0.05)。在病理中低分化組(34/44) 中表達明顯高于病理高分化組(7/16)、神經(jīng)浸潤組(20/23)中表達明顯高于無神經(jīng)浸潤組(21/37)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(17/19)中表達亦明顯高于無轉(zhuǎn)移組(24/41)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但與患者的年齡、性別、腫瘤所處位置并無顯著相關(guān)性。見表2。

圖1 膽管癌組織與癌旁正常膽管組織中GPR120的表達

A:膽管癌組織；B:癌旁正常膽管組織；1:SP×100;2:SP×200;3:SP×400

表1 GPR120蛋白在膽管癌組織和癌旁正常膽管組織中的表達(n)

2.3GPR120的表達與膽管癌患者生存期的關(guān)系60例CCA患者中GPR120陽性表達者41例，陰性表達者19例，失訪7例患者(其中4例失訪者為GPR120陽性表達者，3例為GPR 120陰性表達者)。Kaplan-Meier生存分析顯示陽性表達者的中位生存期為27個月，陰性表達者的中位生存期40個月，經(jīng)Log-Rank檢驗顯示，GPR120蛋白表達陽性患者組與陰性患者組生存率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

表2 膽管癌組織中GPR120蛋白的表達與臨床病理關(guān)系(n)

圖2 膽管癌中GPR120陽性患者、陰性患者的生存曲線

3 討論

GPR120是近年來發(fā)現(xiàn)的一個具有重要功能的G蛋白偶聯(lián)受體，屬于進化保守的視紫紅質(zhì)家族受體，目前的研究[5]表明，飽和與不飽和的長鏈游離脂肪酸(LCFAs)通過激活GPR120受體參與調(diào)節(jié)一系列的代謝過程，如激素分泌、細(xì)胞增殖及脂質(zhì)生成等。GPR120在脂質(zhì)代謝平衡中起到了至關(guān)重要的作用。近年來由于對GPR120研究熱度和深度的增加，越來越多的文獻報道表明，GPR120也在腫瘤發(fā)生、遷移和轉(zhuǎn)移發(fā)生中發(fā)揮重要作用[4]。在消化系統(tǒng)腫瘤中，研究[6-7]顯示GPR120在結(jié)直腸癌和胰腺癌細(xì)胞中表達顯著增高，并對腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移等能力起著明顯的上調(diào)效應(yīng)作用。研究[6]表明，GPR120作為一個人類結(jié)直腸癌中的腫瘤促進受體，在被配體刺激后，GPR120作為PI3K/Akt-NF-κB信號通路傳導(dǎo)過程中的重要環(huán)節(jié)通過介導(dǎo)調(diào)節(jié)促血管生成因子白介素-8(IL-8)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和環(huán)氧合酶-2(COX-2)衍生的前列腺素E2(PGE2)，促進血管生成。同時也發(fā)現(xiàn)GPR120的激活促進結(jié)直腸癌細(xì)胞(CRC)遷移和誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)化(EMT)。這一發(fā)現(xiàn)提供了GPR120在人體中發(fā)揮作用機制的新思路，將最近的脂質(zhì)組學(xué)與癌癥的發(fā)展聯(lián)系起來[6]。但是，GPR120在黑色素瘤中有著不同的作用效應(yīng)。研究[8]表明通過具有皮膚致癌作用的腫瘤促進劑12-O-十四酰基糠醇-13-乙酸酯(TPA)長期刺激，在黑素瘤細(xì)胞中，GPR120負(fù)性調(diào)節(jié)可以促進黑素瘤細(xì)胞遷移侵襲活性增強。以上研究說明GPR120在不同腫瘤中發(fā)揮的作用似乎各不相同。

本團隊在GPR120研究的現(xiàn)有基礎(chǔ)之上，初步探討分析了GPR120在CCA組織以及癌旁正常膽管組織中的表達情況，是否存在差異性表達，是否與臨床病理相關(guān)特征具有密切相關(guān)性。研究結(jié)果顯示GPR120在CCA中的表達與癌旁正常膽管黏膜上皮組織有差異，同樣與膽管癌組織的分化程度、TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯等病理相關(guān)因素有密切關(guān)系，提示GPR120蛋白可能在CCA的發(fā)生發(fā)展和生物學(xué)行為中起到正性上調(diào)作用。另外，本研究顯示GPR120陽性表達患者的中位生存期為27個月，陰性表達患者的中位生存期為40個月，Kaplan-Meier 生存曲線及Log-Rank檢驗提示兩組間中位生存期差異有統(tǒng)計學(xué)意義，亦說明GPR120蛋白可能具有作為膽管癌預(yù)后獨立因素的潛力。必須承認(rèn)的是，本研究是一個典型的單一回顧性研究，且研究樣本相對較小，是從較淺層面上檢測觀察GPR120在CCA中的表達狀態(tài)高于正常膽管組織，提示GPR120蛋白的過表達可能與CCA的惡性程度有關(guān)，但其促進膽管癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的潛在機制目前尚不清楚，需擴大樣本量進一步證實，并在細(xì)胞學(xué)、動物實驗水平進行驗證，并對其具體作用機制進行探索。

總之，CCA作為一種惡性程度高、侵襲轉(zhuǎn)移能力強的消化道腫瘤，常常發(fā)現(xiàn)時已是晚期，生活質(zhì)量較差，且生存時間短，而作為一個新興發(fā)現(xiàn)的重要G蛋白偶聯(lián)受體，GPR120在CCA發(fā)生發(fā)展中可能起到促癌作用，并有希望成為膽管癌早期診斷的一個生物標(biāo)志物和臨床藥物研發(fā)治療的新靶點。

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