他克莫司和伊曲康唑聯合使用體外抗克柔念珠菌作用的研究

宮婷婷，劉赟蕾，王中新

多年來，實體器官移植已經成為腎臟、肝臟、心臟和肺部等終末期疾病的公認治療[1]。隨著免疫抑制劑和移植物的廣泛應用，如真菌病、病毒感染[2]和惡性腫瘤已成為主要的實體器官移植的并發癥。盡管診斷、預防和治療方面最近取得進展，但侵襲性真菌感染仍然是免疫功能低下或危重病患者發病和死亡的主要原因[3-4]。目前非白色念珠菌如光滑念珠菌、克柔念珠菌等菌株的感染已超過白色念珠菌，所致的侵襲性真菌的發病率和死亡率呈現上升的趨勢[4]， 這些難以治療的侵襲性真菌感染的發病率增加，加上目前有限的抗真菌藥物使得仍然未完全探索的鈣調磷酸酶途徑成為抗真菌靶向的有吸引力的新型替代物。其中環孢菌素A和他克莫司就是鈣調磷酸酶抑制劑。而抗真菌藥如氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、卡泊芬凈等的使用，使得難治性的侵襲性真菌的耐藥也不斷的在升高[5-6]，并且上述兩類藥物已廣泛用于器官移植和真菌感染的治療。該實驗通過體外的微量稀釋法，測定12株克柔念珠菌在各種藥物下的耐藥情況，以及分析單獨應用伊曲康唑和他克莫司，與聯合使用伊曲康唑和他克莫司對于克柔念珠菌的生長情況的比較。

1 材料與方法

1.1實驗菌株收集2014年1月～2016年12月安徽醫科大學第一附屬醫院檢驗科分離的克柔念珠菌共12株，菌株來源于痰、尿、糞便等，菌株編號依次為CK1～12。選取光滑念珠菌ATCC MYA-2950和白色念珠菌ATCC 10231作為質控菌株，使用大腸桿菌ATCC 8739作為儀器的校準菌株。

1.2試劑和儀器伊曲康唑、他克莫司、二甲亞砜AR(大連美侖生物技術有限公司)；RPMI 1640粉末(美國GIBCO公司)；MOPS(北京索萊寶技術有限公司)；0.22 μm纖維過濾膜(上海生工生物公司)。VITEK MS-FA、VITEK MS-CHCA基質、靶板和VITEK MS IVD (V2.0) 質譜儀 (法國Biomérieux公司)；酶標儀MK-3(美國ThermoFisher公司)。

1.3方法

1.3.1菌株處理和試劑配制 將菌株從-80 ℃冰箱中取出解凍，至少在沙保弱固體培養基上傳代2次以上進行復蘇，每次在35 ℃恒溫培養箱中培養48 h后再次接種，然后用接種環將沙保弱固體培養基生長至對數生長的單個大菌落，在3 ml的PBS緩沖液中研磨混勻，接著用中國標準比濁管比濁，調整菌液濃度大約在5×106cfu/ml，用血球計數板驗證菌液濃度。將伊曲康唑和他克莫司原料粉末溶于二甲亞砜分別配置為6 400 μg/ml和5 120 μg/ml。

1.3.2藥物單用時最低抑菌濃度測定 采用棋盤微量稀釋法分別測定伊曲康唑和他克莫司的最低抑菌濃度。使用RPMI 1640液體培養基將上述配置的菌體稀釋，使得96孔板上的菌液濃度大約為2.5×103cfu/ml，然后將他克莫司和伊曲康唑的母液用RPMI 1640液體培養基對倍稀釋，使得96孔板上伊曲康唑的濃度為0.125～64 μg/ml、他克莫司的濃度為1～512 μg/ml。參考Sanguinetti et al[7]將克柔念珠菌分離株在伊曲康唑的敏感性分布:最低抑菌濃度≤0.125 μg/ml為敏感，最低抑菌濃度=0.25～0.5 μg/ml為濃度信賴株，最低抑菌濃度≥1.0 μg/ml為耐藥株。

1.3.3藥物聯用時最低抑菌濃度測定 根據CLSI方案M27-A3微量稀釋法測定伊曲康唑和他克莫司聯用后對所有克柔念珠菌的最低抑菌濃度。對于他克莫司使用最高濃度為64 μg/ml，伊曲康唑最高為16 μg/ml。生長對照孔為100 μl RPMI 1640培養液和100 μl菌液，空白對照組為200 μl RPMI 1640培養液，其他每孔100 μl菌液、50 μl伊曲康唑藥液50 μl他克莫司藥液。96孔板在35 ℃恒溫培養箱培養24 h后，用酶標儀在492 nm處測光密度(OD)值。最后根據公式計算各組分級抑菌濃度指數(FICI)：FICI=FICA+FICB=CA/MICA+CB/MICB，FICA、FICB分別表示藥物A和藥物B的分級抑菌濃度；MICA、MICB分別表示藥物A和藥物B單獨應用時的最低抑菌濃度；CA、CB為藥物A和藥物B聯用時達到相同藥效時各自的濃度。聯用作用效果評價根據Odds的建議：分級抑菌濃度指數≤0.5協同，分級抑菌濃度指數>4為拮抗，在其之間為相加或者無關。

1.4統計學處理應用SPSS 16.0軟件進行分析。計數資料采用中位數表示。

2 結果

2.1ATBFUNGUS3參考抗真菌藥敏實驗研究克柔念珠菌分離株由ATB FUNGUS 3根據制造商的說明書進行，目視讀取最小抑制濃度。有5種不同濃度的抗真菌藥物：5-氟胞嘧啶(4～16 μg/ ml)，兩性霉素B(0.5～16 μg/ ml)，氟康唑(1～128 μg/ ml)，伊曲康唑(0.125～4 μg/ ml)和伏立康唑(0.06～8 μg/ ml)。使用CLSI BMD方法同時進行ATB FUNGUS 3的測試，24 h后進行視覺讀數。通過測試CLSI推薦的菌株選取光滑念珠菌ATCC MYA-2950 和白色念珠菌ATCC 10231作為質控菌株來確保質量控制。12株克柔念珠菌的抗真菌藥敏實驗見表1。

2.2伊曲康唑和他克莫司聯合使用抗克柔念珠菌的結果根據CLSI方案M27-A3微量稀釋法進行他克莫司與伊曲康唑聯合應用對抗克柔念珠菌的生長情況,最后根據公式計算各組分級抑菌濃度指數。他克莫司與伊曲康唑聯用時12株克柔念珠菌的結果見表2。與單獨使用伊曲康唑的克柔念珠菌相比，聯合用藥作用下伊曲康唑最低抑菌濃度遠小于單獨使用伊曲康唑的克柔念珠菌，其最高倍數達32倍，最小倍數達4倍；同樣，他克莫司單獨使用較聯合伊曲康唑使用，最高倍數達32倍，最低倍數達2倍。

3 討論

近年來，念珠菌屬、隱球菌和曲霉屬物種的耐藥分離株種群數量不斷增加，以及最近新出現的接合線蟲種，木霉菌和米根霉的出現[8]，這些都是免疫功能低下患者死亡率高的原因[9]。臨床侵襲性操作如氣管插管、導尿以及介入等使用造成了克柔念珠菌的感染呈現逐年上升的趨勢。對于常見的三唑類真菌藥-伊曲康唑，其耐藥的情況也在逐年的升高。He et al[10]認為ERG11和ABC2基因的上調與克柔念珠菌的耐藥機制相關，但卻不能排除ERG11基因在此過程中突變引起的耐藥。而隨著器官移植的增多，免疫抑制劑(他克莫司和環孢素A)已被廣泛的使用，他克莫司是鈣調神經磷酸酶抑制劑，鈣調神經磷酸酶是由Ca2+和鈣調蛋白調節的真菌中唯一認識的磷酸酶。它是一種多功能調節劑，具有調節真菌應激反應、生理和細胞周期進程、生物膜的形成和抗真菌抗性、毒力以及發病機制的功能。

表1 12株克柔念珠菌在下列各藥物中的濃度

表2 12株克柔念珠菌聯合使用伊曲康唑和他克莫司的結果

注：a代表3次實驗的中位數

在基于上述情況下，研究新的抗真菌藥一直在進行，如嗜鉻粒蛋白A-N46對克柔念珠菌表現出最大的敏感性，嗜鉻粒蛋白A-N46可以被認為是用于治療克柔念珠菌感染的抗真菌化合物[11]。銀納米顆粒、羧甲基殼聚糖等都能夠抑制念珠菌細胞的代謝活性。但上述藥物都未進行臨床人體試驗。Lamoth et al[12]證實了各種唑類和鈣調磷酸酶抑制劑抗真菌活性，如耐棘白菌素類的煙曲霉臨床分離株。最近一項研究[13]顯示他克莫司或環孢素A和氟康唑的組合靶向鈣調磷酸酶信號傳導可能是用于白色念珠菌感染后產生生物膜預防和治療抗真菌的有效策略。鈣調神經磷酸酶抑制劑增強白色念珠菌對最常見的抗真菌劑敏感性的基礎機制。在此之前Li et al[14]研究發現他克莫司和氟康唑聯合抗光滑念珠菌和克柔念珠菌具有協調作用。

基于上述研究和氟康唑對克柔念珠菌是天然耐藥以及他克莫司作為臨床上常用的器官移植后的免疫抑制藥，筆者選用了較為廉價的伊曲康唑聯合他克莫司抗克柔念珠菌。通過本研究發現體外單獨使用抗真菌劑(伊曲康唑)或鈣調神經磷酸酶抑制劑(他克莫司)對克柔念珠菌的作用與伊曲康唑和他克莫司相結合的抗克柔念珠菌的活性相比較，后者在抗克柔念珠菌時，無論是敏感的還是耐藥的伊曲康唑，都明顯降低了克柔念珠菌的生長情況。因此，在治療器官移植后克柔念珠菌的感染時，應用他克莫司和伊曲康唑聯合治療，在臨床上是有一定的應用前景。

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