TPL2促進口蹄疫病毒在BHK-21細胞復制

魏南南，徐守興，史喜娟，盧炳州，張克山，鄭海學，劉湘濤(中國農業科學院蘭州獸醫研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室農業部畜禽病毒學重點開放實驗室 國家口蹄疫參考實驗室，蘭州 730046)

口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)引起的急性、烈性、高度接觸性傳染病，易感動物是牛、羊、豬等偶蹄動物。FMDV屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)的單股正鏈RNA病毒[1]。已知FMDV有七種血清型FMDV(A、O、Asia1、C、SAT1、SAT2和SAT3)和多個亞型[2-3]。口蹄疫病毒包含RNA基因組，其由二十面體衣殼包圍，衣殼由四種結構蛋白VP1、VP2、VP3和VP4各60個分子構成。FMDV基因組全長約為8.5 kb，包含一個大的開放閱讀框，被翻譯為一個多聚蛋白前體。病毒的多聚蛋白被病毒編碼的蛋白酶(Lpro和3Cpro)處理，產生15種不同的蛋白以及多種前體物質[4]，其中包括3種結構蛋白(VP0、VP1和VP3)以及8種非結構蛋白(L、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)[5]。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)級聯反應，是細胞內主要的信號轉導途徑。MAPKs在大量炎癥和疾病的發病機制中扮演至關重要的角色，同時也是免疫、癌變和細胞凋亡途徑的調節劑[6]。MAPK信號轉導在病原誘導宿主保護性反應中發揮重要功能，研究發現許多病毒可以直接利用這些途徑利于其自身復制[7]。TPL2(tumor progression locus 2)又稱COT(cancer Osaka thyroid)/MAP3K8，是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶。TPL2信號轉導在先天性和適應性免疫以及在癌癥中作為潛在的原癌基因起著重要作用[6]。研究表明TPL2在穩態條件下結合p50(NF-κB1)的前體蛋白p105，其可以阻斷TPL2的激活[8-9]。Toll樣受體或TNF受體超家族的配體，可以激活IKKα/β也能導致p105蛋白的水解，釋放TPL2，并允許未知激酶激活TPL2[10-11]?；罨腡PL2直接磷酸化MAP2K MEK，然后激活MAPK ERK[12]。除了這個主要功能之外，TPL2還涉及MAPK8(JNK)、MAPK14(p38)和轉錄因子NFAT和NF-κB的活化[13]。因此，TPL2可以在轉錄或轉錄后調控一些基因表達包括促炎細胞因子和二級介質，以及抗炎性細胞因子[14]。在LPS刺激巨噬細胞中，TPL2的缺失會使TNF-α的產生減少； TPL2-/-小鼠同WT小鼠相比，對李斯特菌、結核分枝桿菌和流感病毒的易感程度增加[15-16]；同時也發現LPS或TLR9的配體CpG刺激TPL2缺失的巨噬細胞和樹突狀細胞導致IL-1β的產生減少[17]； TPL2可能通過調節抗原呈遞細胞APC中IL-12和IL-23的表達從而參與平衡Th1/ Th17分化[18]。TPL2在先天免疫中的作用僅限于細菌感染模型，使用病毒病原體進行的相關研究比較少。

TPL2與FMDV的致病性仍不清楚，為明確TPL2在FMDV致病過程中發揮的作用，本研究對FMDV易感BHK-21細胞的TPL2基因進行感染試驗，利用實時定量PCR技術評價FMDV感染BHK-21細胞，又分別進行過表達和RNAi，利用實時定量PCR和Western blotting技術評價FMDV的復制，證實TPL2可以促進FMDV復制，為進一步深入研究FMDV的免疫機制積累了數據。

1 材料與方法

1.1 材料

口蹄疫毒株A/GDMM/CHA/2013和BHK-21細胞由本實驗室提供；兔抗TPL2多抗購于Abcam公司(ab137589)；鼠抗Flag單抗、HRP標記山羊抗鼠IgG二抗和HRP標記山羊抗兔IgG二抗均購于Santa Cruz公司；鼠抗β-actin單抗購于Thermo Scientific公司(MA1-140)；抗FMDV全血清由本實驗室制備，Western blotting檢測可顯出VP0、VP1和VP3蛋白條帶。

大腸桿菌Trans5α感受態、LATaqDNA聚合酶、限制性核酸內切酶KpnⅠ和XbaⅠ、T4 DNA連接酶、Trizol試劑、RNA酶抑制劑(RRI)、Oligo(dT)引物、隨機引物、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、SYBR Permix ExTaqⅡ和蛋白預染Marker均購于寶生物工程大連有限公司；5×First Buffer、0.1 mol·L-1DTT、反轉錄酶M-MLV和LipofectamineTM3000轉染試劑均購于Invitrogen公司；Opti-MEM、0.25% EDTA胰酶和新生牛血清(FBS)均購于Gibco公司；MEM 細胞培養液和PBS溶液購于Hyclone公司；ECL顯色劑購于Thermo Scientific公司；NP-40裂解液和PMSF購于碧云天公司；TPL2干擾序列由上海吉瑪制藥有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 TPL2真核表達質粒的構建 設計并合成TPL2引物，引入酶切位點KpnⅠ和XbaⅠ，以真核表達質粒pCMV3-N-Flag為載體，構建pCMV3-TPL2-Flag表達質粒，進行PCR擴增、酶切和序列測定。

1.2.2 TPL2 RNAi設計與合成 設計并合成TPL2 RNAi序列。分別設計了3對針對TPL2基因的RNAi序列，引物序列見表1，由上海吉瑪制藥有限公司合成。

表1本試驗用到的干擾、引物序列

Table1RNAiandprimersequencesusedinthisstudy

基因Gene干擾、引物序列(5′→3′)RNAiandprimersequencesTPL2?354Forward：GCAUUUAAAUGUGUCGGAATTReverse：UUCCGACACAUUUAAAUGCTTTPL2?855Forward：GCAUGAGAACAUUGCUGAATTReverse：UUCAGCAAUGUUCUCAUGCTTTPL2?1500Forward：GGACUCUGCCCUCUUUGAATTReverse：UUCAAAGAGGGCAGAGUCCTTNegativeForward：UUCUCCGAACGUGUCACGUTTcontrolReverse：ACGUGACACGUUCGGAGAATTTPL2Forward：AAGACATTGCTGGTGACTGCAGTReverse：GGATTCAAGGCTTCGTGTTTCAGAPDHForward：GAGAAACCTGCCAAGTATGATGACReverse：AGAGTGGGAGTTGCTGTTGAAGFMDVForward：CACTGGTGACAGGCTAAGGReverse：CCCTTCTCAGATTCCGAGT

1.2.3 細胞的轉染和細胞感染 將細胞消化后鋪于細胞板中，置于37 ℃、5%CO2培養箱中，待細胞長至70%～90%時，將質粒與LipofectamineTM3000中的LipofectamineTM3000試劑(兩者按照比例為1 μg∶2 μL)分別加至Opti-MEM中，同時還需將LipofectamineTM3000中的P3000試劑加至有質粒的Opti-MEM中(兩者按照比例為1 μg∶2 μL)，如果轉染為siRNA無需將P3000試劑加至有siRNA的Opti-MEM，之后直接將兩者混合，靜止15 min；將Opti-MEM混合物直接加至細胞中；將細胞重新置于37 ℃、5%CO2培養箱中進行培養24 h。

轉染24 h后，用無血清的MEM將細胞清洗兩遍，以去除細胞中殘留的血清，用1 MOI FMDV感染BHK-21細胞，置于37 ℃、5%CO2培養箱孵育1 h之后，棄去含有病毒的培養基，換成2%FBS MEM維持液，繼續培養。

1.2.4 RNA的提取及反轉錄 采用Triozl裂解法提取細胞的總RNA，并反轉錄為cDNA模板用于實時定量PCR，反轉錄體系20.0 μL：4 μL 5×First buffer，2 μL 0.1 mol·L-1DTT，1 μL oligo(dT)，0.5 μL Radom primers，1 μL RNA酶抑制劑RRI，1 μL M-MLV反轉錄酶，1 μL dNTPs，4.5 μL DEPC水，5 μL RNA模板。反應程序：25 ℃ 10 min，37 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min。

1.2.5 TPL2過表達試驗 將細胞消化后鋪于細胞板中，待細胞長至60%～70%時，分別轉染不同劑量的TPL2真核表達質粒，同時在轉染過程中轉入pCMV3-N-Flag空載體來設置對照。在轉染后24 h，用1 MOI FMDV感染BHK-21細胞，感染10 h收取兩份細胞樣品；一份用于實時定量PCR，以GAPDH作為內參，分別檢測TPL2和FMDV轉錄水平的變化；另一份用于Western blotting，以β-Actin作為內參，分別檢測Flag-TPL2和FMDV蛋白水平的變化。

1.2.6 TPL2 siRNA干擾試驗 將細胞消化后鋪于細胞板中，待細胞長至50%～60%時，分別轉染NC siRNA 和TPL2 siRNA，轉染36 h后，感染1 MOI FMDV，分別在感染后0、4、8和12 h收取兩份細胞樣品；一份用于實時定量PCR，以GAPDH作為內參，分別檢測TPL2和FMDV轉錄水平的變化；另一份用于Western blotting，以β-actin作為內參，分別檢測TPL2和FMDV蛋白水平的變化。

1.2.7 Western blotting 細胞蛋白樣品的制備：棄去培養液，用1×PBS漂洗細胞2次，去除細胞碎片；加入適量的NP-40裂解液，并在使用前數分鐘內加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1 mol·L-1；充分裂解后，12 000 r·min-1離心10 min，將樣品上清收集于新準備的EP管中，再加入5×SDS Loading Buffer(已加β-巰基乙醇)，100 ℃煮樣10～15 min。

SDS-PAGE蛋白凝膠電泳及轉?。号渲?0%聚丙烯酰胺蛋白膠；取適量的蛋白樣品上樣，同時加上蛋白預染Marker作為大小的指示；電泳電壓先調80 V跑30 min，待蛋白樣品跑出濃縮膠進入分離膠后，將電壓調至120 V，直至電泳結束;電泳結束后200 mA，轉膜2 h；轉膜結束后，利用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；封閉之后，TBST洗2次，每次5 min；孵育一抗，4 ℃過夜(一抗可以回收利用)；TBST快洗3次，每次10 min；孵育二抗，室溫孵育2 h；TBST快洗3次，每次10 min；用高分辨圖像采集系統進行ECL顯影并保存結果。

1.2.8 實時定量PCR 實時定量PCR的反應體系(20 μL)：10 μL SYBR Permix ExTaqⅡ，0.8 μL上游引物，0.8 μL下游引物，7 μL DEPC水，ROXⅡ0.4 μL和1 μL cDNA。反應程序：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火加延伸34 s，共40個 循環。定量引物序列見表1所列，引物序列由金唯智公司合成。

2 結 果

2.1 FMDV感染BHK-21細胞致內源性TPL2轉錄水平上調

將BHK-21細胞鋪于35 mm小皿中，待細胞長至80%～90%時，根據試驗方法“1.2.3”進行感染試驗，分別在0、20、40、60 min收取細胞樣品，進行實時定量PCR，以GAPDH作為內參，分別檢測TPL2和FMDV轉錄水平的變化。結果表明隨著FMDV的轉錄水平的上升，TPL2的轉錄水平也呈現顯著的上調(圖1)。

2.2 TPL2過表達促進FMDV的復制

2.2.1 Flag-TPL2真核質粒的構建及表達 構建Flag-TPL2真核質粒，進行PCR擴增、酶切和序列鑒定正確(圖略)，將構建的Flag-TPL2真核質粒以不同的劑量轉染BHK-21細胞，轉染后24 h，收取細胞樣品，Western blotting驗證Flag-TPL2真核質粒的表達。結果表明，構建的Flag-TPL2真核質粒可以在BHK-21細胞中表達，并且呈現劑量依賴性(圖2)。

A.實時定量檢測FMDV轉錄水平的變化；B.實時定量檢測TPL2轉錄水平的變化A.The mRNA level of FMDV was detected by qPCR; B. The mRNA level of TPL2 was detected by qPCR

圖1 FMDV感染誘導TPL2轉錄水平上調Fig.1 FMDV infection induced an increase of TPL2 transcriptional level

圖2 Western blotting驗證TPL2蛋白在BHK-21細胞表達Fig.2 Verification the expression of TPL2 protein by Western blotting in BHK-21 cells

2.2.2 過表達TPL2促進FMDV在BHK-21細胞中的復制 按照試驗方法“1.2.5”，轉染不同劑量Flag-TPL2真核表達質粒，發現隨著TPL2轉錄水平的上升(圖3A)，FMDV的轉錄水平也呈現上調的趨勢(圖3B)；同時檢測了蛋白水平的變化，與轉錄水平變化一致，隨著TPL2蛋白表達的增加，FMDV蛋白的表達水平呈現明顯上調的趨勢，并且呈現劑量依賴性(圖3C)。結果表明，過表達TPL2促進FMDV在BHK-21細胞中的復制。

2.3 TPL2 siRNA干擾效果

將siRNA-354、siRNA-855、siRNA-1500和NC siRNA分別轉染BHK-21細胞，設置不同的轉染劑量和作用時間后收集細胞樣品，同時用qRT-PCR和Western blotting檢測不同TPL2 RNAi序列對TPL2轉錄水平及表達水平的干擾作用。結果表明，編號為TPL2-1500的干擾序列在轉染濃度為150 pmol·mL-1以及作用時間為36 h時，TPL2轉錄水平(圖4A)及蛋白表達水平(圖4B)干擾效果最佳。

A.實時定量檢測TPL2轉錄水平變化；B.實時定量檢測FMDV轉錄水平變化；C.Western blotting檢測TPL2和FMDV蛋白水平變化A.TPL2 transcription was detected by qPCR; B.FMDV transcription was detected by qPCR; C.TPL2 and FMDV proteins were detected by Western blotting

圖3 過表達TPL2促進FMDV在BHK-21細胞中復制Fig.3 Overexpression of TPL2 enhanced FMDV replication in BHK-21 cells

A.實時定量檢測TPL2轉錄水平變化；B. Western blotting檢測TPL2蛋白水平變化A.TPL2 transcriptional level was evaluated by qPCR; B.TPL2 protein level was evaluated by western blotting

圖4 鑒定BHK-21細胞中TPL2 siRNA的干擾效率Fig.4 Evaluation of the efficiency of TPL2 siRNA in BHK-21 cells

2.4 下調表達內源性TPL2抑制FMDV在BHK-21細胞中的復制

利用siRNA干擾技術，下調內源性TPL2蛋白表達，觀察FMDV在BHK-21細胞中復制的變化。結果表明，在不同時間點與對照組相比，TPL2轉錄水平下調(圖5A)，FMDV的mRNA水平也呈現下調的趨勢(圖5B)；同時檢測蛋白水平的變化，在不同時間點與對照組相比，發現TPL2蛋白表達下調，FMDV的蛋白表達水平也是呈現下降的趨勢(圖5C)，即下調表達內源性TPL2抑制FMDV在BHK-21細胞中的復制。

A.實時定量檢測TPL2轉錄水平變化；B.實時定量檢測FMDV轉錄水平上的變化；C.Western blotting檢測TPL2和FMDV蛋白水平變化A.TPL2 transcriptional level was detected by qPCR; B.FMDV transcriptional level was detected by qPCR; C.TPL2 and FMDV protein levels were detected by Western blotting

圖5 下調表達內源性TPL2抑制FMDV的復制Fig.5 Downregulation of endogenous TPL2 inhibited FMDV replication

3 討 論

病原體為了自身在宿主中進行復制和傳播，會破壞宿主的防御機能，以抵抗天然免疫系統，比如FMDV在體外可以主動抑制宿主干擾素的產生[19-20]。另外，FMDV或者FMDV合成的一些蛋白質可以通過抑制宿主蛋白的翻譯或轉錄水平來拮抗宿主的先天性反應[21]。FMDV的前導蛋白酶Lpro通過破壞干擾素(IFN)信號通路抑制宿主先天免疫應答從而來促進病毒的復制[21]，FMDV的3Cpro通過剪切干擾素信號通路中接頭蛋白NEMO來抑制病毒刺激產生IFN-α/β[22]，另外它還能阻斷IFN信號通路中STAT1和STAT2的入核[23],近期有研究表明3Cpro可以通過溶酶體途徑誘導雙鏈RNA活化蛋白激酶(PKR)降解，從而拮抗宿主PKR介導的抗病毒作用[24]。 FMDV的結構蛋白VP1也可以抑制Ⅰ型IFN的誘導，FMDV的非結構蛋白2B蛋白可以與RIG-Ⅰ相互作用，降低RIG-Ⅰ在宿主細胞中的表達，來抵抗宿主的抗病毒機制[25]。FMDV的非結構蛋白3A通過與干擾素信號通路中的接頭蛋白 RIG-Ⅰ，MDA5和VISA相互作用，此外3A還破壞RIG-Ⅰ、MDA5和VISA 的mRNA水平的變化，表明3A抑制RLR介導的IFN-β[26]?？傊現MDV通過自身的一些結構蛋白或者非結構蛋白與宿主蛋白作用，從而來逃避宿主的免疫系統。

TPL2在天然免疫中起著關鍵的作用，在調節TNF-α，Toll樣受體和G蛋白偶聯受體信號中起著重要的作用[27]。TPL2通過促進ERK依賴性誘導c-fos(AP-1異二聚體轉錄因子的組成成分)，在調節IFN產生起重要作用[28]。同時TPL2是以細胞類型特異性方式針對模式病毒配體的刺激有差異地調節IFN產生[16]。在漿細胞樣樹突狀細胞(pDCs)中通過TPL2誘導產生IFN-α，而在TPL2-/-的CD4+T細胞中分泌IFN-γ的能力顯著減弱，但是在巨噬細胞和DCs中，TPL2卻是IFN-β有效的負調節因子[28-29]。TPL2在不同的組織中都有廣泛的表達，但是在各組織中具體的功能報道較少，對于其與病毒之間的相互作用以及具體分子機制相關的報道也是所知甚微。有研究表明TPL2以細胞類型特異性方式差異性地調控流感病毒感染所涉及的PRRs下游的IFN產生，在TPL2-/-的巨噬細胞和上皮細胞，TPL2抑制Ⅰ型干擾素的產生，而在pDCs中是促進Ⅰ型和Ⅲ型干擾素的產生[28]。TPL2在調節IFN-α/β和IFN-λ產生過程中至關重要，在流感病毒的研究當中，發現在pDCs中TPL2是通過激活Akt和ERK誘導IFN-λ的產生來抵抗流感病毒的感染[17]。在有關丙型肝炎病毒(HCV)的研究報告中，miR-17-5p和miR-17-5p靶向TPL2 3′UTR來抑制TPL2蛋白表達從而抑制HCV的復制[30]。FMDV可以通過各種方式來逃避宿主的天然免疫系統，而TPL2在天然免疫的過程中也發揮著至關重要的作用，所以，關于TPL2是否調節IFN的產生進而影響FMDV在BHK-21細胞中復制將是下一步的研究方向和重點。

4 結 論

首先使用FMDV感染BHK-21細胞，發現TPL2的轉錄水平顯著上調，表明TPL2與FMDV感染復制之間有著必然的聯系。其次，本研究成功構建Flag-TPL2真核質粒，并且通過Western blotting驗證了其能夠正常表達。通過過表達TPL2蛋白，可以顯著促進FMDV在BHK-21細胞中復制，同時下調表達TPL2會抑制FMDV在BHK-21細胞中復制。本研究表明在FMDV易感的BHK-21細胞中，FMDV的復制和TPL2的表達呈正相關性，即TPL2是促進FMDV在BHK-21細胞中復制，通過FMDV感染試驗，以及過表達和干擾兩個試驗，從轉錄水平和蛋白質水平兩個方面證明TPL2可以促進FMDV在BHK-21細胞中復制。

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