基于WNT／β-catenin通路研究石斛合劑對衰老糖尿病大鼠脂代謝的調控機制

劉 赟 ，林心君 ，施 紅 ，許 茜

（1.福建中醫藥大學臨床技能教學中心，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州 350122）

目前，全世界糖尿病患者日趨增多，據世界衛生組織估量，至2050年，全球糖尿病患者將超過3億。糖尿病患者存在脂代謝紊亂的情況，而肝臟脂代謝的異常又能促進2型糖尿病的發展。有研究表明，慢性游離脂肪酸的升高和胰島細胞內脂質的增加能促使胰島β細胞凋亡；高脂血癥又使糖尿病患者心血管疾病的發病率增加，因此在治療糖尿病的同時要積極降低患者的血脂［1］。石斛合劑具有滋陰、清熱、益氣、活血、瀉濁等功效，通過以往的研究發現，該合劑能夠降低糖尿病大鼠血糖，改善血脂，并且其作用顯著優于西藥二甲雙胍［2-3］。本研究通過對衰老糖尿病大鼠肝臟基因芯片的分析，探討石斛合劑調控衰老糖尿病大鼠肝臟脂代謝的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 50只12周齡SPF級雌性Wistar大鼠，體質量（200±20）g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可證號：SCXK（滬）2017-0005。

1.2 實驗藥物 石斛合劑1、2號方：石斛、黃芪、五味子、丹參等，3號方：茵陳、大黃、梔子、五味子等。鹽酸二甲雙胍緩釋片（廣東省藥物研究所制藥廠）。

1.3 實驗試劑和儀器 烏拉坦（國藥集團化學試劑有限公司，批號：T20100310）；基因表達譜雜交試劑盒（Agilent technologies，Santa Clara，CA，US，Cat#5188-5242）；基因表達譜洗片試劑盒（Agilent technologies，Santa Clara，CA，US，Cat#5188-5327）；兔抗鼠-β-catenin多克隆抗體（武漢博士德生物技術公司）；基因芯片掃描儀（Agilent technologies，Santa Clara，CA，US，Cat#G2565CA）；7180 型自動生化分析儀（日立公司）；FJ2008PS型γ放射免疫計數器（西安核儀器廠）。

2 實驗方法

2.1 藥液制備 石斛合劑1、2、3號方分別按生藥含量為2.0 g／mL滅菌后100 mL分裝一瓶，分裝保存備用。

2.2 建立模型 適應性喂養7 d，根據課題組前期工作研究［2］，隨機分為正常對照組10只和造模組40只，分別喂養基礎飼料和高脂高糖飼料12個月后，造模組予腹腔注射低劑量的鏈脲佐菌素（STZ）20 mg／kg，注射 1次，3 d之后篩選出隨機血糖≥16.7 mmol／L的衰老糖尿病模型大鼠32只，隨機分為模型組10只、二甲雙胍組10只、石斛合劑組12只。

2.3 干預 石斛合劑組按 12 g／（kg·d）予石斛合劑灌胃，第1～5天予石斛合劑1號方灌胃，第6～10天予石斛合劑2號方灌胃，第11～12天予石斛合劑3號方灌胃，此為1個療程，共灌胃2個療程；二甲雙胍組按 50 mg／（kg·d）予二甲雙胍灌胃；正常對照組和模型組予等量生理鹽水灌胃。每日1次，共干預24 d。

2.4 觀察指標及方法

2.4.1 生化指標檢測 動物處死后取腹主動脈血，應用自動生化分析儀檢測甘油三脂（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和膽固醇（CHOL）。

2.4.2 HE染色 取肝臟切片常規脫臘，入水。100%酒精脫洗5 min 2次，95%酒精、80%酒精各脫洗5 min，自來水充分沖洗5 min。蘇木素浸泡5 min，自來水沖洗；1%鹽酸分化，自來水沖洗；伊紅染液中染色2 min；依次于70%、80%、90%、95%酒精梯度酒精脫水各2 min，100%酒精10 min脫水2次，二甲苯透明后，中性樹膠封片。

2.4.3 免疫組化檢測肝臟β-鏈蛋白（β-catenin）表達量 包埋、切片、脫蠟和水化后，用自來水沖洗。對組織抗原進行相應的修復，并用 PBS沖洗3次，除去PBS液。每張片加1滴或50 μL 3%過氧化氫，在室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，各3 min。每張切片加1滴或50 μL非免疫山羊血清，室溫下孵育10 min后直接甩去液體。每張切片加50 μL的第一抗體，室溫下孵育60 min，PBS沖洗 3次，各3～5 min。除去 PBS液，每張切片加 50 μL即用MaxVisionTM試劑，室溫下孵育 15 min，PBS沖洗 3次，各3 min。除去PBS液，每張切片加100 μL新鮮配制的DAB顯色液，作用5 min，顯微鏡下觀察。自來水沖洗，蘇木素復染，PBS或自來水沖洗返藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。設空白二甲雙胍組，用PBS液沖洗，不加1抗，其余各步驟與其他切片相同。

2.4.4 基因芯片檢測 取肝臟組織交由上海伯豪生物工程有限公司進行Angilent大鼠全基因組表達譜芯片測試，芯片名稱為：Agilent Whole Rat Genome Oligo Microarray（4×44K）。

2.5 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件進行數據處理。計量資料符合正態分布以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。基因芯片采用上海伯豪生物技術公司SAS在線分析系統進行生物信息學分析，計算差異倍數值（fold change，FC）。

3 結 果

3.1 4 組大鼠血清 HDL、LDL、TG、CHOL 水平比較見表1。

表1 4 組大鼠血清 HDL、LDL、TG、CHOL 水平比較（x±s）mmol／L

3.2 肝臟HE染色 模型組肝細胞結構紊亂，細胞胞漿疏松化，有些則呈氣球樣變，炎細胞浸潤明顯，纖維組織增生，包繞匯管區；二甲雙胍組和石斛合劑組肝細胞結構稍紊亂，氣球樣變、炎細胞浸潤較模型組明顯減少。見圖1。

圖1 4組大鼠肝臟HE染色圖（×40）

3.3 免疫組化檢測β-catenin 模型組β-catenin高表達，并且可見部分細胞核出現表達，大部分細胞核移位，脂肪變性較嚴重；二甲雙胍組有部分 βcatenin表達于細胞質；但細胞核未見β-catenin表達，部分細胞核移位；石斛合劑組β-catenin表達量、核移位、脂肪變性少于二甲雙胍組。見圖2、表2。

圖2 4組大鼠肝臟β-catenin免疫組化圖（×400）

表2 4組大鼠肝臟β-catenin表達比較（x±s）

3.4 脂代謝相關基因芯片結果 見表3、4。判定標準：FC值≥2的基因為表達顯著上調基因，FC值≤0.5為表達顯著下調基因。

4 討 論

2型糖尿病的患者多數存在脂代謝紊亂，而高血糖和高血脂導致糖尿病的并發癥，例如動脈粥樣硬化等，而動脈粥樣硬化是糖尿病患者致死的首要原因［4］，長期的高血脂能降低機體各組織對胰島素的敏感性。因此，調節糖尿病脂代謝的紊亂相當重要。傳統中醫認為糖尿病的病位在脾（胃）、肝、腎，多為虛實夾雜，即以陰虛或者氣陰兩虛為本，痰濁血瘀為標。在疾病初期多以標實為主，情志失調，繼而痰濁化熱傷陰；后期以本虛為主，且多為陰陽兩虛，并兼有痰濁、瘀血，而痰濁和瘀血又相互影響，耗傷氣血、損傷臟腑［5］。 林蘭教授［6］認為糖尿病分為三型：即陰虛熱盛、氣陰兩虛、陰陽兩虛，分別代表著糖尿病病程的早、中、晚三個時期，基本證候為氣陰兩虛，兼有血瘀，而陰虛則貫穿整個糖尿病的發病過程。本實驗針對臨床2型糖尿病本虛標實的病機特點，確立以標本兼治、扶正祛邪為主的治療原則，先采用益氣、滋陰、活血，兼以生津、清熱的1、2號方，再佐以利濕泄濁的3號方，扶正與祛邪分而治之，以免功效互抵，并注意在祛邪時不傷正。本研究通過對衰老糖尿病大鼠肝臟組織基因芯片的分析，旨在探索石斛合劑治療糖尿病，特別是調節肝臟脂代謝的相關通路，為石斛合劑治療糖尿病的機制研究提供方向。

表3 石斛合劑組對比模型組表達明顯下調的基因

表4 模型組明顯下調或上調，經石斛合劑治療后恢復正常的基因

通過對血清學的檢查發現經石斛合劑治療后衰老糖尿病大鼠血清LDL、TG、CHOL水平顯著降低，HDL水平顯著升高?；蛐酒瑑蓛蓪Ρ劝l現，石斛合劑組對比模型組叉頭框蛋白Q1（forkhead box Q1，FOXQ1）、WNT1 誘導信號通道蛋白 2（WNT1 inducible signaling pathway protein 2，WISP2）基因表達顯著下調；通過石斛合劑的治療，模型組對比正常對照組下調的低密度脂蛋白受體相關蛋白-5（low density lipoprotein receptor-related protein 5，LRP5）、無翅型MMTV整合位點家族成員7A（wingless-type MMTV integration site family，member 7A，WNT7A）基因恢復正常表達，上調的WISP2基因恢復正常表達。FOXQ1能參與調節WNT／β-catenin信號通路，有研究表明，在肝癌的患者中FOXQ1呈高表達，而當FOXQ1沉默時可以抑制肝癌細胞血管的生成［7］。當WISP2和其他WNT激活的標志物表達增加時，能增加肥胖、內臟脂肪積累和胰島素抵抗［8］。WNT7A屬于WNT家族，能夠抑制細胞增殖，促進細胞的凋亡［9］。LRP5屬于低密度脂蛋白受體相關蛋白，是WNT經典通路中的一個受體，其能參與巨噬細胞的脂質吸收。WNT通路中的主要組成有配體如WNT家族分子、跨膜受體如LRP5、胞漿調節蛋白β-catenin等。β-catenin在WNT經典通路中有著相當重要的作用，有研究表明，WNT／βcatenin通路的活化不僅能增加病毒性肝炎患者病毒的表達，還能促進肝癌細胞的侵襲和遷移，使肝癌的預后不良［10-12］。通過基因芯片的研究發現石斛合劑能使衰老糖尿病大鼠LRP5、WNT7A基因恢復到正常水平，將衰老糖尿病大鼠顯著上調的WISP2基因恢復到正常水平，提示石斛合劑可能主要是通過“糾偏”達到調控衰老糖尿病大鼠脂質代謝的作用；通過石斛合劑的治療能夠降低FOXQ1基因表達，提示石斛合劑可能具有抑制衰老糖尿病大鼠肝癌發生的作用。通過對免疫組化結果的分析發現，石斛合劑組、二甲雙胍組β-catenin的表達量均顯著低于模型組，提示石斛合劑可能是通過調節WNT／β-catenin信號通路起到抑制肝臟癌變、減少內臟脂肪積累等達到調節肝臟脂代謝的作用。

通過本研究我們發現石斛合劑能通過“糾偏”達到調節WNT／β-catenin信號通路的作用。通過對已知基因的研究發現，石斛合劑能通過控制脂肪生成，增加脂肪酸的β氧化，促進脂肪分解及脂肪酸的運輸，通過調節WNT信號通路，從而降低血清LDL、TG、CHOL水平，升高 HDL水平，起到保護肝臟、減少肥胖、減輕內臟脂肪積累、降低胰島素抵抗的作用，從而對糖尿病大鼠脂代謝起到調控的作用。

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