推拿手法對頸椎病家兔骨骼肌ATP mRNA表達(dá)的影響

王志強(qiáng)，竇思東，林麗莉，毛忠清，陳炬烽

（福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院，福建 福州 350122）

長期低頭位引起的頸椎動力性平衡——頸項(xiàng)部肌肉的功能異常是頸椎病發(fā)病的主要病因。在頸椎病發(fā)生發(fā)展過程中，頸背部肌張力異常升高、肌力減弱、動力性失衡，逐漸引起脊柱靜力系統(tǒng)（椎體及附件、椎間盤和相連韌帶）失衡，形成惡性循環(huán)，是頸椎病發(fā)病的關(guān)鍵所在［1］。頸部肌肉的損傷既是頸椎病發(fā)病的一個重要病因，也是該病重要的癥狀體現(xiàn)，因此探討其病變肌肉的病理變化情況，對揭示頸椎病的發(fā)病機(jī)制和治療機(jī)理具有重要的意義。推拿手法是臨床保守治療頸椎病的有效手段［2-3］，該療法直接作用于肌肉，其起效過程必然與其對肌肉的影響存在密切聯(lián)系。故我們采用低頭位法制備頸椎病家兔模型，觀察推拿手法對肌張力及骨骼肌三磷酸腺苷酶（ATP）mRNA表達(dá)的變化，探討手法治療頸椎病的內(nèi)在機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 日本大耳白家兔40只，雌雄各半，體質(zhì)量（2.30±0.16） kg，6～7 月齡，購自福建醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 主要試劑和儀器 頸復(fù)康顆粒（承德頸復(fù)康藥業(yè)股份有限公司，批號：710065）；RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、熒光定量PCR試劑盒（康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號：0051501、00041501、0031505）；PCR 引物（南京金斯瑞生物科技公司）；7500 Fast熒光定量PCR儀 （美國Applied Biosystems公司）；Nano Drop 2000超微量核酸測定儀（美國Thermo公司）；ST 16R高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo公司）；XW-80A微型漩渦混合儀 （上海滬西分析儀器廠）；TPA-2型智能推拿手法參數(shù)測定儀（由上海中醫(yī)藥大學(xué)和復(fù)旦大學(xué)共同開發(fā)研制）；SA7550肌電圖誘發(fā)電位儀（加拿大flexcomp infiniti公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模與分組 按體質(zhì)量編號，根據(jù)分層隨機(jī)原則，利用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件的Proc Plan過程隨機(jī)化將兔子按1∶3比例分為正常組和造模組，先將造模組環(huán)境適應(yīng)性訓(xùn)練3 d，采用低頭位法造模：每天將動物固定于特定的兔架上，使其頸椎處于低頭屈曲45°的異常應(yīng)力環(huán)境下，每日5 h，連續(xù)操作12周。以表面肌電檢測張力顯著變化作為造模是否成功的客觀標(biāo)準(zhǔn)。造模結(jié)束后將造模組隨機(jī)分為模型組、藥物組、推拿組各10只。

2.2 干預(yù) 造模后第2天完成表面肌電檢測后進(jìn)行相應(yīng)干預(yù)。其中藥物組按1 g／（kg·d）予頸復(fù)康顆粒進(jìn)行灌胃。推拿組采用一指禪推法［4］在家兔大椎穴上吸定操作，手法的輕重頻率通過TPA-2型智能推拿手法參數(shù)測定儀標(biāo)定，在前期已由專人按手法要求訓(xùn)練達(dá)標(biāo)，一指禪手法操作參數(shù)：頻率120次／min，每次治療15 min，每日1次。藥物組、推拿組均干預(yù)10 d，正常組和模型組無干預(yù)治療。

2.3 取材 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，稱量家兔體重，各組家兔腹腔注射3%戊巴比妥鈉25 mL／kg經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉，解剖家兔迅速取出兩側(cè)后斜方肌，4℃預(yù)冷的生理鹽水清洗，濾紙吸干肌肉組織表面的水分并稱重，計算家兔指數(shù)（斜方肌質(zhì)量／體質(zhì)量），將一側(cè)肌肉立即投入4%中性甲醛固定液中固定，另一側(cè)肌肉液氮速凍，-80℃冰箱保存。

2.4 觀察指標(biāo)及方法

2.4.1 表面肌電檢測 分別于造模完成第2 d及干預(yù)后進(jìn)行表面肌電的檢測，并提前1 d對家兔后斜方肌周圍進(jìn)行剃毛備皮處理。在電極片上涂抹好導(dǎo)電膏，正、負(fù)極與參考電極呈正三角形分布，每個電極中心點(diǎn)距離2 cm，正負(fù)極順著受檢肌肉的肌纖維軸向放置，將其固定于后斜方肌上；接通肌電信號收集器，采用2通道的Rms+三維頻譜的通道，背景參數(shù)高通濾波器設(shè)置在10～20 Hz，低通濾波器設(shè)置在400～450 Hz，開始收集肌電信號，待信號平穩(wěn)后截取靜息階段數(shù)據(jù)，觀察其波幅變化。

2.4.2 ATP mRNA檢測 采用熒光定量PCR方法測定，以GAPDH為內(nèi)參。將RNA提取后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。 配制 10 μL 反應(yīng)體系：dNTP Mix 2 μL，Primer Mix（引物）1 μL，RNA 模板 4.5 μL，5×RT Buffer 2 μL，SuperQuickRT Mix 0.5 μL，而后渦旋震蕩混勻，短暫離心，37℃孵育15 min，85℃孵育5 s；反應(yīng)結(jié)束后短暫離心，所得的cDNA可放在-20℃長期保存。最后進(jìn)行熒光定量PCR檢測：① 配制25 μL反應(yīng)體系。完成之后，短暫離心；② 進(jìn)行PCR反應(yīng)程序：采用三步法（變性，退火，延伸）擴(kuò)增循環(huán)。每個樣本做3個復(fù)孔，將3個復(fù)孔得到的Ct值取平均，并根據(jù)2-ΔΔCt計算出mRNA相對表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計量資料符合正態(tài)分布以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。

3 結(jié) 果

3.1 4組干預(yù)前后肌張力比較 見表1。

表1 4組干預(yù)前后肌張力比較（x±s） μV

3.2 4組ATP mRNA表達(dá)水平比較 見表2。

表2 4 組 ATP mRNA 表達(dá)水平比較（n＝3，x±s）

4 討 論

流行病學(xué)調(diào)查表明，不良的勞動姿勢是職業(yè)性肌肉骨骼損傷的一個重要因素，其中最主要的是強(qiáng)迫體位的影響［4］，而強(qiáng)迫屈頸體位是頸椎病發(fā)病的危險因素之一。強(qiáng)迫體位使機(jī)體產(chǎn)生的靜態(tài)負(fù)荷容易引起肌肉疲勞，血液循環(huán)減弱，可致組織缺血，代謝產(chǎn)物清除減慢，長時間可造成肌肉損傷。當(dāng)肌肉疲勞時，它的肌電一般表現(xiàn)為肌纖維的興奮傳導(dǎo)速度減慢，波幅一般有一定的增加。我們的實(shí)驗(yàn)表明：造模12周后，家兔肌電圖表現(xiàn)出了肌源性損害，肌張力顯著增高，經(jīng)過藥物或推拿治療后，家兔的肌電圖征象明顯好轉(zhuǎn)，且推拿組波幅降低程度明顯高于藥物組，提示推拿對頸椎病肌張力的改善效果顯著優(yōu)于藥物治療。

肌肉組織由于長期缺血缺氧，線粒體功能障礙，ATP生成不足，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也觀察到了這類現(xiàn)象，這使依賴于 ATP供能的各類酶活性下降［5］。再者，因代謝產(chǎn)物的減慢，導(dǎo)致自由基生成增加，而自由基也是酶損傷的重要因素，可導(dǎo)致其活性下降［6］。 Na＋-K＋-ATP 酶活性下降主要使細(xì)胞膜電位紊亂，Ca2＋-ATP酶活性下降導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載激惹一系列代謝紊亂，兩者均可致結(jié)構(gòu)退變，甚至喪失生命力［7］。而整個肌細(xì)胞的損傷，最終導(dǎo)致骨骼肌損傷。椎后肌肉如若不能正常調(diào)節(jié)頸椎動力學(xué)平衡，導(dǎo)致動力系統(tǒng)失衡，進(jìn)一步引起頸部椎體-韌帶-椎間盤組織構(gòu)成的靜力平衡系統(tǒng)的失衡，最終導(dǎo)致整個頸椎系統(tǒng)生物力學(xué)功能的紊亂，使頸椎穩(wěn)定性喪失，出現(xiàn)頸椎間盤的退變而發(fā)病。在這個病變過程中，我們的研究結(jié)果提示：及早進(jìn)行推拿手法治療能有效提高ATP酶mRNA的表達(dá)，有助于促進(jìn)ATP酶的合成和活性，從而減輕或者避免肌細(xì)胞的損傷，進(jìn)而有利于頸椎動力系統(tǒng)平衡的恢復(fù)。在下一步的實(shí)驗(yàn)中，我們將深入觀察推拿手法對該疾病病理過程中ATP酶合成和活性的影響。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示：① 手法能有效改善頸椎病的高張力狀態(tài)，顯著降低肌張力；表面肌電在一定程度上能有效反映頸椎病的疾病狀態(tài)和治療效果，可以作為臨床頸椎病評價的一種客觀指標(biāo)。②作為臨床頸椎病保守治療的常用手段，手法治療頸椎病療效顯著，這與手法能顯著促進(jìn)頸椎病骨骼肌ATP酶mRNA的表達(dá)，促進(jìn)ATP酶的合成和活性，挽救肌細(xì)胞，存在一定的相關(guān)性，其內(nèi)在機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。③本次選用的一指禪推法具有刺激舒適、滲透性強(qiáng)等優(yōu)勢，易于被患者所接受，配合大椎穴激發(fā)陽氣，通督扶陽，把手法和穴位扶助陽氣的作用結(jié)合取得了顯著的效果，這種效果我們將在下一步臨床實(shí)驗(yàn)中加以驗(yàn)證。

［1］ 王擁軍.施杞教授關(guān)于頸椎病理論與臨床的探討［J］.中國中醫(yī)骨傷科雜志，1997，5（3）：60-62.

［2］ 王昊，左偉斌，張慧，等.推拿對慢性神經(jīng)根型頸椎病疼痛相關(guān)腦區(qū)的影響［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2017，23（6）：854-857，860.

［3］ 許軍，顧非，劉鯤鵬，等.三步推拿法治療頸型頸椎病臨床推廣應(yīng)用研究［J］.天津中醫(yī)藥，2018，35（1）：25-27.

［4］ 王起恩，王生，牛云彤，等.強(qiáng)迫體位致骨骼肌線粒體動態(tài)變化的研究［J］．中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志，1996，14（3）：142-144.

［5］ 徐建廣，顧玉東，李繼峰.缺血對失神經(jīng)肌肉超微結(jié)構(gòu)及酶組織化學(xué)的影響［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2003，20（6）：499-500.

［6］ 吳小春.自由基與鈉鉀 ATP酶的損傷［J］.國外醫(yī)學(xué)（臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊），1991，12（2）：54-58.

［7］ 沈燕國，徐建光，顧玉東，等.人體失神經(jīng)支配骨骼肌 Na，KATP酶、Ca-ATP酶及糖原的變化［J］.復(fù)旦學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2002，29（5）：343-346.