八寶丹對人臍靜脈內皮細胞增殖和遷移的影響

關建華 ，靳祎祎 ，莊群川 ，2，黃 彬 ，彭 軍 ，2，魏麗慧 ，2，林久茂 ，2

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122）

血管生成在腫瘤發生等病理生理過程中起重要作用。腫瘤血管新生與腫瘤生長及遷移有著密不可分的聯系［1］，新生的血管為腫瘤細胞的生長和轉移提供氧氣和營養，與腫瘤細胞增殖、轉移呈正相關。若無血管系統提供氧氣和養料，實體瘤的增長不會超過1 mm3，因此，抗血管生成是腫瘤治療的主要策略。血管新生是個復雜的過程，主要涉及血管內皮細胞的增殖、遷移等過程［2］。名貴中成藥八寶丹（Babao Dan，BBD）具有清熱利濕、活血解毒、祛黃止痛等功效。相關研究顯示BBD治療腫瘤臨床療效顯著，可明顯減輕化療藥物對肝功能的損傷，與化療合用可以減緩患者痛楚，改善臨床癥狀，提高生活質量，減輕或延緩化療藥物引起的外周血象下降速度，降低感染的幾率，延長臨床生存期［3-4］。同時，研究結果表明八寶丹干預后的腫瘤細胞增殖能力降低，凋亡增加，細胞遷移數目減少［5］。但BBD抗腫瘤作用機制方面的研究尚不系統和深入，多停留在藥效作用觀察上。本文通過觀察BBD對血管內皮細胞增殖和遷移的影響，探討其抑制腫瘤血管新生的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞 人臍靜脈內皮細胞（HUVEC），購于中南大學湘雅細胞中心。

1.2 實驗藥物 BBD（廈門中藥廠股份有限公司，0.3 g／粒），使用磷酸鹽緩沖液（PBS）配制成 25 mg／mL的藥液。

1.3 實驗試劑 胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶、RPMI 1640培養基（美國Life technologies公司）；青霉素-鏈霉素混合液（美國Thermo公司）；MTT粉末、結晶紫（北京索萊寶科技有限公司）。

1.4 實驗儀器 超凈工作臺（蘇州凈化設備公司）；二氧化碳培養箱（美國Thermo公司）；DMIL LED倒置顯微鏡系統（德國Leica公司）；連續波長多功能酶標儀（奧地利TECAN公司）；Countes?全自動細胞計數儀（美國Life technologies公司）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養 HUVEC采用RPMI 1640完全培養基（含 10%FBS、100 U／mL 青霉素、100 μg／mL 鏈霉素），置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養。

2.2 細胞活力分析 采用MTT法進行細胞活力分析。取對數生長期的HUVEC按1×104個／孔接種于96孔培養板中（100 μL／孔），培養細胞匯合度達到50%～60%時，將細胞分成對照組和實驗組，吸棄培養液，對照組每孔加入不含BBD的培養液100 μL，實驗組每孔加入含不同濃度 BBD（0.25、0.5、0.75 mg／mL）培養液 100 μL，培養 24 h 后每孔加入100 μL MTT（0.5 mg／mL）繼續培養 4 h，吸棄液體后加入 DMSO 100 μL／孔，室溫放置 10 min，充分振蕩混勻后于酶標儀（波長570 nm）測吸光度（A）值。細胞活力與細胞生長抑制率計算公式如下。

細胞活力／%＝實驗組A值／對照組A值×100%；

細胞生長抑制率／%＝（對照組A值－實驗組A值）／對照組A值×100%。

2.3 觀察細胞形態 取對數生長期的HUVEC按2×105個／孔接種于 6孔培養板中（2 mL／孔），培養細胞匯合度達到50%～60%時，細胞經不同濃度BBD（0、0.25、0.5、0.75 mg／mL）干預 24 h 后，使用倒置顯微鏡對細胞的形態變化進行觀察并拍照。

2.4 劃痕損傷修復實驗 取對數生長期的HUVEC按6×105個／孔接種于6孔培養板中（2 mL／孔），當匯合度達到80%～90%時進行劃痕，用20 μL無菌槍頭裝于移液器槍頭處，握住移液器采用一定力度垂直于板底進行橫線劃痕，隨后吸出原培養基，每孔加1 mL PBS清洗3遍，最后一次PBS保留不吸出，拍照即記為0 h，然后吸棄PBS，加入含不同濃度 BBD（0、0.25、0.5、0.75 mg／mL）的完全培養液培養，分別干預12 h和24 h后隨機取5個視野，倒置顯微鏡下觀察拍照。

2.5 Transwell遷移分析 HUVEC經不同濃度BBD（0、0.25、0.5、0.75 mg／mL）干預處理 24 h 后，吸棄含藥培養基，消化離心收集細胞，用空白培養基重懸調整細胞密度為2.5×105個／mL，上室內加入200 μL 包含有 5×104個細胞，下室加入 700 μL 完全培養基，放入恒溫箱培育12 h后吸棄培養基，用干棉棒輕輕擦拭小室內部，使用蘸有PBS的棉簽輕輕擦拭小室內部（切記不要捅破小室）；4%多聚甲醛固定和結晶紫染色，PBS洗滌后于倒置顯微鏡鏡下隨機選取5個視野拍照。

2.6 統計學處理 采用SPSS 22.0統計軟件對數據進行處理。計量資料符合正態分布以（x±s）表示，采用t檢驗；計數資料采用χ2檢驗。

3 實驗結果

3.1 BBD對HUVEC增殖的影響 見表1。

3.2 BBD對HUVEC形態的影響 倒置顯微鏡觀察結果顯示HUVEC經不同濃度BBD干預24 h后，BBD可減少HUVEC的細胞密度，并使部分細胞脫落，呈劑量依賴作用。見圖1。

3.3 BBD對HUVEC劃痕損傷修復的影響 劃痕損傷修復實驗結果顯示BBD對HUVEC的劃痕損傷修復具有明顯的抑制作用，且具有明顯的劑量依賴。見圖2。

表1 BBD 對 HUVEC 增殖的影響（n＝8，x±s）

圖1 BBD對HUVEC形態的影響（×200）

圖2 BBD對HUVEC劃痕損傷修復的影響（×100）

3.4 BBD對HUVEC遷移能力的影響 Transwell實驗結果顯示BBD對HUVEC的遷移能力有明顯的抑制作用，隨著BBD劑量增大，遷移的細胞逐漸減少，具有顯著的量效作用。見圖3。

4 討 論

圖3 BBD對HUVEC遷移能力的影響（×100）

腫瘤生長及其轉移灶形成的最根本原因是依賴于血管的形成［6］。血管新生在實體腫瘤的生長、惡變以及轉移等方面至關重要［7］，是一個復雜的、受高度調控的生理過程［8］，其中血管內皮細胞向腫瘤移行是一個重要環節，內皮細胞通過增殖、游走、黏附到相應部位構成血管樣結構，這表明抗血管生成治療在抑制腫瘤進展方面是有效的［9］。因此，針對抑制血管內皮細胞的增殖、遷移，使腫瘤血管生成得到抑制，從而切斷腫瘤細胞的營養來源，抑制其生長與轉移。

BBD起源于明代，距今已有四百多年的臨床應用歷史，主要由牛黃、三七、羚羊角、蛇膽、珍珠、麝香等藥物組成，具有清利濕熱、活血解毒、去黃止痛之功效［10］，其臨床應用于治療傳染性病毒性肝炎、急性膽囊炎、急性泌尿系感染等。近年來，圍繞其清熱利濕、活血止痛、抗炎解毒的功能，現代醫學專家不斷探討與實踐，該方應用范圍逐漸擴大，在惡性腫瘤、自身免疫性疾病以及其他疑難雜癥的治療方面也取得了良好的效果［3-5，11］。

在本研究中，我們以HUVEC為研究對象，用不同濃度BBD進行干預，觀察其對HUVEC的增殖和遷移的影響，MTT檢測結果顯示不同濃度的BBD可顯著抑制HUVEC的增殖，具有一定的劑量依賴性。血管內皮細胞遷移是血管新生的重要驅動因素，劃痕（修復）法是簡捷測定細胞遷移運動與修復能力的方法，體外觀察細胞是否生長（修復）至中央劃痕區，以此判斷細胞的生長遷移能力［12］。在本實驗中，BBD對HUVEC的劃痕損傷修復具有明顯的抑制作用，呈現明顯的劑量依賴作用，提示BBD可抑制HUVEC細胞的遷移能力。此外，血管內皮細胞穿透基底膜脫離原部位是發生血管新生的另一關鍵環節。Transwell是通過計算相同時間內穿過小孔膜的細胞數來反映細胞遷移能力，穿過小孔膜的細胞數越多，遷移能力越強［12］。Transwell實驗結果表明，對照組有較多的細胞穿過小孔膜，BBD干預后穿過小孔的細胞數量逐漸減少，說明BBD能顯著降低HUVEC的遷移能力。

綜上可見，BBD可通過抑制血管內皮細胞增殖及遷移來發揮抑制血管新生的作用，為此提示BBD治療腫瘤的作用機制可能與其抑制腫瘤血管新生有關。但血管新生是個復雜的過程，涉及多個因素、多個環節、多種細胞因子、多條信號通路等協同調控的多步驟過程，因此有關BBD抑制血管新生的分子作用機制有待進一步闡明。

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