二甲雙胍對2型糖尿病大鼠非酒精性脂肪性肝病相關慢性炎癥反應的影響

蔡鳳 劉鉅榮 范德美 沈靜雪

沈陽醫學院附屬中心醫院（沈陽110000）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種肝臟的代謝應激性損傷，是全球最常見的一種慢性代謝性肝病之一。它由非酒精性單純性脂肪肝（NAFL）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）兩個臨床病理實體組成，而后者有發展為肝硬化和肝細胞癌的可能［1］。而2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）亦是全球最常見的一種代謝性疾病。大量研究表明，這2種疾病不僅在臨床上密切相關，且存在共同的發病機制，即胰島素抵抗（IR）和慢性炎癥反應［2-4］。隨著研究逐漸深入，人們發現TNF-α、IL-6等炎癥因子作為機體發生慢性炎癥的早期標志物，在NAFLD、IR和T2DM的相互關系中發揮著重要的作用［5］。有研究表明，“2013版中國2型糖尿病防治指南”中治療2型糖尿病的一線藥物——二甲雙胍（metformin，Met），對NAFLD也有一定的治療作用［2］，但關于Met對T2DM相關的NASH及其纖維化改變的作用，目前尚未報道。本研究通過建立單純T2DM、T2DM合并NAFLD及Met干預的T2DM合并NAFLD的大鼠模型，觀察T2DM合并NAFLD大鼠胰島素抵抗、肝功異常情況及TNF-α、IL-6、CRP的表達情況，及給予Met后，上述指標的改變，初步探討TNF-α、IL-6及CRP在T2DM合并NAFLD中的作用機制及Met對于T2DM合并NAFLD大鼠的慢性炎癥反應、NASH及其纖維化改變的影響。

1 材料與方法

1.1 動物模型建立與處理 40只SPF級雄性SD大鼠（體質量250～300 g）（沈陽醫學院附屬中心醫院實驗動物中心提供），適應性喂養1周后，采用隨機數字法，將其隨機分為4組，分別為A組（對照組）、B組（T2DM組）、C組（T2DM+NAFLD組）、D組（T2DM+NAFLD+Met組），每組10只。A組給予普通飼料喂養，B組給予普通高糖高脂飼料喂養，C、D兩組均給予改良高糖高脂高熱能飼料喂養，喂養4周后，4組大鼠均禁食13 h，給予大鼠稱重、尾靜脈測血糖后，B、C、D組大鼠分別一次性腹腔注射1%STZ 35 mg/kg（由pH值4.2～4.5的檸檬酸緩沖液配置），破壞其胰島，制備T2DM模型，A組大鼠腹腔內一次性注射等量生理鹽水形成對照。注射成功后4 h監測大鼠血糖，造模不成功者，3 d后補充注射STZ 25 mg/kg。繼續監測大鼠血糖2周，達到穩定≥16.7 mmol/L為造模成功的T2DM大鼠模型。D組給予150 mg/（kg·d）Met灌胃8周。其余各組大鼠均給予等量清水灌胃，形成對照。造模結束后，禁食水8 h，深麻醉下，腹主動脈采血，于肝右葉取2塊1 cm×1 cm大小的肝組織，以4%多聚甲醛固定。血液離心，取上清液，一部分以生化分析儀檢測其血糖、肝功等指標，另一部分保存于-80℃冰箱中待檢測。

1.2 血清生化指標及IL-6、TNF-α檢測 空腹血糖、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、谷酰轉肽酶（GGT）及CRP水平用生化分析儀檢測；空腹胰島素（Fins）及IL-6、TNF-α水平應用ELISA試劑盒檢測。通過空腹血糖及Fins水平，計算穩態模型評估胰島素抵抗指數（HOMAIR）=空腹胰島素水平（IU/mL）×空腹血糖水平（mmol/L）/22.5及胰島素敏感性指數（ISI）=1/［空腹胰島素水平（IU/mL）×空腹葡萄糖水平（mmol/L）］，用以評估胰島素敏感程度。

1.3 病理學檢測 HE染色法按照常規步驟進行，根據其結果進行肝臟炎性活動積分標準及肝臟脂肪含量計分標準（NAS），評分結果作為評估其肝臟脂肪變及炎性改變程度的指標［6-7］。

油紅O染色、Masson染色及網狀纖維染色分別按照試劑盒中說明書步驟進行。油紅O染色結果根據油紅O染色評分方法進行評分［8］，Masson染色及網狀纖維染色結果根據肝纖維組織半定量計分方法（SSS評分）進行評分［6］。

1.4 肝組織TNF-α、IL-6及CRP蛋白表達檢測 免疫組化法采用EnVision法進行，采用盲法，由兩位經驗豐富的病理科醫生獨立采用半定量評分法對結果進行分析。TNF-α、IL-6及CRP蛋白表達參考Fromowitz等方法作為評分標準［9］。

1.5 統計學方法 應用SPSS 17.0統計軟件。先對所有數據進行正態性檢驗，呈正態分布的結果，用±s表示，采用t檢驗的方法，進行兩兩比較；對于非正態分布者，采用非參數檢驗的方法，對數據進行分析。將P＜0.05（雙側）界定為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胰島素敏感程度及肝功指標比較 比較各組HOMA-IR及ISI結果，可見，B、C組HOMA-IR高于A組，ISI低于A組，B、D組HOMA-IR低于C組，ISI高于C組（均P＜0.01）。各組ALT、AST及GGT水平對比，與HOMA-IR結果平行。見表1。

2.2 血清TNF-α、IL-6及CRP水平比較 各組TNF-α及IL-6比較結果與肝功結果平行，CRP結果對比，B、C組高于A組（其中B組與A組相比，P＜0.05，C組與A組相比，P＜0.01），D組低于C組（P＜0.01），B、C組之間無差異（P＞0.05）。見表1。

2.3 肝組織TNF-α、IL-6及CRP蛋白表達情況比較 免疫組化染色：A組大鼠肝組織中，極少數肝細胞內可見棕黃色陽性顆粒表達，主要見于胞質表達；B、C、D組肝組織中均可見陽性表達，其中C組肝細胞內可見大量黃色、棕黃色顆粒聚集，陽性表達細胞數量多于B、D組，且顏色較B、D深。其半定量分析各組間結果比較與血清指標比較結果平行。見表1、圖1。

2.4 大鼠肝臟病理改變 動物實驗結束后，4組大鼠各死亡2只。外觀看，實驗組大鼠毛色、活動度及體重增長速度均較對照組差。肝臟肉眼觀察可見，C組肝臟腫大、質脆，表面油膩，被膜緊張，呈紅黃相間似檳榔。HE染色、油紅O染色、Masson染色及網狀纖維染色圖像及評分結果示：C組大鼠存在明顯的肝脂肪變、脂肪性炎變及纖維化改變，Met干預組上述病變較C組改善。見圖1。

表1 各組HOMA-IR及肝功指標結果Tab.1 Results of HOMA-IR and liver function in each group x±s

圖1 各組HE、Masson、網狀纖維染色及TNF-α、IL-6、CRP免疫組化結果Fig.1 Results of HE,masson,reticular fiber staining and TNF-α,IL-6 and CRP immunohistochemical staining in each group

3 討論

TNF-α、IL-6及CRP由巨噬細胞、脂肪細胞等多種細胞分泌，可通過多種途徑，促進IR的發生，加重其進展，進而促進T2DM及NAFLD的形成。而胰島素敏感性和抵抗力依賴于胰島素與胰島素受體底物之間的特異性的通路，如單磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMPK）通路、核因子κB（NF-κB）信號轉導通路及磷脂肌醇信號通蛋白激酶C（PKC）-θ通路等［10］。而炎癥因子可抑制信號在胰島素與其底物之間特異性通路內的正常傳導，造成胰島素的敏感性下降、抵抗力增加，即IR。

炎癥因子可通過增加葡萄糖轉運因子-4（GLUT-4）易位，進而下調GLUT-4的生物活性［11-12］，抑制骨骼肌周圍組織對葡萄糖的利用，增加IR，并通過激活NF-κB信號轉導通路［13-16］，誘導信號抑制因子3（SCOS3）蛋白表達［17-18］等途徑抑制胰島素信號通路的傳導，損害組織對于胰島素的敏感性。而脂肪細胞具有抵抗胰島素的作用，NAFLD的脂肪細胞可抵抗胰島素的影響，加重脂肪的分解，多余的FFA被肝臟等其他器官再次吸收，加重NAFLD，形成惡性循環，進一步誘發肝臟的炎癥壞死及纖維化［19-21］。

作為“指南”中治療T2DM的一線藥物，Met不僅可改善IR，還能夠降低FFA水平，改善脂肪異位沉積，抑制NAFLD的形成［2，22-24］。Met可通過阻礙電子的傳遞鏈，抑制ATP合成，促進AMP堆積，進而激活AMPK通路，同時抑制糖異生的發生［25-27］。而AMPK的激活，一方面可誘導GLUT-4在脂肪細胞和肌肉細胞上的表達，促進胰島素信號的傳導，增加葡萄糖的轉運［28］。另一方面，AMPK可作用于其沉默調節蛋白1（SIRT1），激活NF-κB信號轉導通路，同時，還可降低炎癥因子的表達，改善慢性炎癥狀態［29］。另外，Met可上調過氧化物酶體增殖物受體γ（PPAR-γ）及其輔激活子 1α（PPGC-1）在外周的脂肪、骨骼肌等組織的表達，進而在基因層次上，調節線粒體脂肪酸氧化酶的表達，增加脂肪酸β氧化酶的轉錄活性，進而促進氧化磷酸化的發生，增加脂質代謝，延緩NAFLD的發生［30-31］。Met還可通過增加血清超氧化物歧化酶活性，降低ROS及丙二醛含量，改善氧化應激［32-33］。Met通過介導上述炎癥通路的激活及改善組織的氧化應激抑制促炎因子的分泌，促進抗炎因子的生成與釋放，改善組織慢性炎癥狀態，延緩IR進展。

綜上所述，本研究證實炎癥因子TNF-α、IL-6及CRP在T2DM合并NAFLD大鼠呈高表達，T2DM合并NAFLD中存在明顯的胰島素抵抗、肝功異常及慢性炎癥狀態，Met可延緩T2DM合并NAFLD的進展及NAFLD相關的NASH及肝纖維化改變的進展，考慮其機制與降低炎癥因子的表達，改善慢性炎癥狀態有關，但本實驗仍需更多的臨床及基礎研究，對其進行進一步的驗證及對作用機制進行進一步研究。

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