海府地區(qū)慢性HBV感染者病毒基因型與BCP/PC區(qū)變異的研究*

梁 寧 鄭 青 張淑芳 張英愛 高麗娟

1?？谑?20急救中心 (海南 海口， 570311) 2?？谑腥嗣襻t(yī)院

HBV 感染自然史分為4 期：免疫耐受期、免疫清除期、免疫不全期和再活動期[1]。HBV對肝臟的損害取決于兩個因素，一個是宿主免疫應(yīng)答情況，另一個是HBV的基因型和異質(zhì)性[2]。海南省HBsAg攜帶率為8.4%，有70萬人的巨大傳染源[3]。由于HBV基因型具有地域分布特點[4]，HBV異質(zhì)性可能帶來不同的臨床后果，因此，筆者試圖研究慢性HBV感染者自然史不同免疫狀態(tài)下的HBV基因型和病毒變異狀況，為慢性HBV感染者實施相應(yīng)的干預(yù)措施提供實驗數(shù)據(jù)與理論支持，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月至2017年8月期間?？谑腥嗣襻t(yī)院住院治療的200例慢性HBV感染者作為研究對象。所有入選者的臨床診斷均以2015年頒布的《慢性乙型肝炎防治指南》為標準[5]。依照HBV感染自然史分為4組：①A組，共50例，入選標準：HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBV DNA>104copies/ml、ALT正常(1年內(nèi)連續(xù)隨訪超過3次，ALT均在正常范圍)；②B組，共50例，入選標準：HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBV DNA>104copies/ml、ALT持續(xù)或間歇升高；③C組，共50例，入選標準：HBsAg(+)、HBeAg(-)、抗HBe(+)、HBV DNA低于最低檢測限，1年內(nèi)連續(xù)隨訪3次以上，ALT均在正常范圍；④D組，共50例，入選標準：HBsAg(+)超過半年以上、HBeAg(-)和/抗-HBe(+)、HBV DNA≥104copies/ml，ALT超出1.5倍正常值上限。排除標準：①合并抗-HCV、抗-HDV、抗-HIV陽性者；②急性肝炎、重型肝炎、肝硬化、肝癌患者；③用免疫抑制劑治療的患者。

1.2 實驗儀器與方法

1.2.1 實驗儀器 研究級別倒置相差熒光顯微鏡 (日本OLYMPUS IX71 )， 凝膠成像系統(tǒng) (美國Bio-Rad：GelDoc XR)，梯度快速PCR儀( 美國Bio-Rad：C1000)， 電擊轉(zhuǎn)基因儀/MicroPluser電穿孔儀和制冰循環(huán)水浴儀( 美國Thermofisher：RTE 7)，擴增儀 (美國Bio-Rad：MJ MINI )，電子天平(美國奧豪斯：SPS202F)，渦旋混合器(美國Scientific Industries：Vortex-Genie 2 )，雜交/交聯(lián)箱(美國Boekel：Bambino(230301-2))，真空離心濃縮儀(德國Eppendorf：5301 plus)，超聲波細胞破碎儀(美國MISONIX：XL2000)，高溫滅菌器(日本Hirayama：HVE-50)，多功能酶標儀(美國Bio-rad：Xmark )，超低溫冰箱(-85℃)、低溫冰箱(-20℃)、低溫高速離心機、臺式高速離心機、電泳儀、無菌超凈工作臺、測序儀器、切割式勻漿機、FR-紫外強見光分析系統(tǒng)、手提式長波長紫外燈、貝克曼DXC800全自動生化分析儀，雅培16000生化免疫一體機，日立7600全自動生化分析儀，全自動酶標檢測儀等。

1.2.2 HBV基因型分析 采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析法(PCR-RELP)，首先通過擴增S基因區(qū)，再根據(jù)特殊的基因型特異性位點設(shè)計內(nèi)切酶，具體步驟如下：提取HBV DNA 2μl，總體積20μl，第一輪擴增用BS1和POL2作為外引物，經(jīng)過變性、退火、延伸后，取出5μl產(chǎn)物，反應(yīng)總體積50μl。第二輪擴增用YS1和YS2作為內(nèi)引物，再次經(jīng)過變性、退火、共循環(huán)、再延伸5min，取出4μl產(chǎn)物電泳并觀察；取陽性產(chǎn)物5μl， Bsrs I和StyI各4u酶切，取產(chǎn)物電泳并觀察。

1.2.3 PC/BCP變異檢測 ①CX片段(nt1643-1974)擴增： 提取HBV DNA2μl，以外引物P9和P35擴增，總體積20μl，經(jīng)過變性、退火25s、延伸、共循環(huán)、再延伸后，取產(chǎn)物5μl，以P9和CSP為內(nèi)引物再擴增，總體積50μl，再經(jīng)過變性、退火、共循環(huán)、再延伸后，取產(chǎn)物4μl，電泳并觀察。②測序：取擴增成功且產(chǎn)物帶明顯的樣本測序，引物為CSP，HBV基因組第1762A/1764T以及1896G核苷酸變異的判斷采用Cluster X 進行序列排列和人工確認。

1.3 檢測指標 ① 檢測4組患者的基因型。② 4組患者HBV的PC/BCP變異情況并計算比率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理。計數(shù)資料采用(n)或百分比(%)表示，兩組間比較采用χ2檢驗，取P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組患者HBV基因型的檢測情況 見表1。

表1 4組患者HBV基因型分布情況比較 [n(%)]

組間比較，P均>0.05

2.2 4組患者HBV變異類型及比率 結(jié)果顯示，PC區(qū)A1896終止密碼變異均發(fā)生于基因型B，BCP 區(qū)A1762T/G1764A雙變異均發(fā)生于基因型C。隨著HBV感染自然史的進展，PC變異的比率并未出現(xiàn)太大變化，組間比較P均>0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；但BCP變異的比率卻逐漸增高，組間比較P均<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 4組患者HBV變異類型及比率比較 [n(%)]

3 討論

HBV 基因型的分布具有地域特點，目前已證實，在我國大陸地區(qū)主要以B、C兩型為主，南方B型多見，北方C型多見[6]。研究表明HBV基因型可能影響著慢性肝病的臨床表現(xiàn)和病程轉(zhuǎn)歸[7]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)從慢性HBV感染到肝硬化、再到原發(fā)性肝癌，基因C型患者所占的比例顯著上升；相對于B型，C型患者更容易出現(xiàn)較嚴重的肝臟病變[8]。本研究排除了肝硬化和原發(fā)性肝癌患者，僅針對慢性HBV感染的4個不同階段，結(jié)果顯示，4個免疫階段患者HBV基因型的分布情況均以B型為主，且其構(gòu)成比例差異不大(P>0.05)，與既有的文獻結(jié)論相符。

HBV病毒較其他DNA病毒存在較高的變異率，原因是HBV復(fù)制過程中的逆轉(zhuǎn)錄酶并不具有校正修復(fù)功能，其中最主要的是PC變異和BCP變異[9]。研究表明基因型B、D、E及部分C、F基因型較易出現(xiàn)PC變異，基因型C則更易出現(xiàn)BCP雙變異[10]。有文獻指出BCP變異與慢性HBV感染的進展有關(guān)，與原發(fā)性肝癌具有更為密切的關(guān)系，而PC變異則與肝病進展不甚密切[11]。病毒學(xué)研究發(fā)現(xiàn)BCP可以通過對PC-mRNA和C-mRNA的控制來調(diào)節(jié)HBV的轉(zhuǎn)錄，當發(fā)生BCP變異后，一方面PC-mRNA被抑制，改變了PC-mRNA和C-mRNA的比率，病毒的復(fù)制效率發(fā)生了改變；另一方面，生成了肝細胞核因子HNF1的結(jié)合位點，使得pgRNA的轉(zhuǎn)錄和HBcAg合成增強，核心顆粒增加，從而顯著地增強HBV復(fù)制，引發(fā)了更為嚴重的肝細胞炎癥、壞死和纖維化修復(fù)；同時，BCP變異還能誘導(dǎo)HBV X蛋白的氨基酸改變，而發(fā)生改變后的X蛋白在HBV感染發(fā)展為HCC過程中起著重要作用[12]。筆者發(fā)現(xiàn)PC變異均發(fā)生于基因型B，BCP變異均發(fā)生于基因型C，隨著慢性HBV 感染自然史的進展，PC變異的比率并未出現(xiàn)太大變化，但BCP變異的比率卻逐漸增高，這再次證實BCP變異在肝病進展中可能具有的作用。

綜上所述，海府地區(qū)慢性HBV感染進程的4個階段(免疫耐受期、免疫清除期、免疫不全期和再活動期)均以B型基因為主，但是隨著慢性HBV 感染自然史的進展，BCP變異比率逐漸增高，表明BCP變異可能是原發(fā)性肝癌進程中的重要事件。

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