一種微孔板法檢測食品中添加維生素B12含量的方法

高利海

維生素B 12（V B 12），又稱鈷胺素（Cobalamin），是人體中非常重要的水溶性維生素之一，主要用于嬰幼兒奶粉、谷物食品、保健食品、乳品和功能性飲料等食品中營養強化。目前針對食品中B12檢測方法，國標有GB 5009.217《保健食品中維生素B12測定》、GB 5413.14《嬰幼兒食品和乳品中維生素B12測定》，但由于食品成分復雜、存在多種干擾因素，因此化學分析法的應用受到限制，目前國際仍以微生物法作為首選方法。

雖然微生物法檢測VB12具有較高的靈敏度和精確度，但GB5413.14方法，步驟繁瑣、操作耗時、檢測周期長、易受外部因素干擾等諸多問題。本文采用德國拜發公司微孔板法對嬰幼兒配方奶粉、谷物米粉、含乳飲料、功能飲料等食品中添加VB12含量的測定，實驗穩定性非常好。

材料與方法

材料與儀器：VitaFast Vitamin B12試劑盒（德國拜發P1002）、微量移液器20- 200μl；100- 1000μl（eppendorf）、50ml離心管，2.0 ml EP管、一次性無菌注射器（帶0.2μm無菌濾膜）（Axygen）；生物安全柜（賽默飛世爾1374）、酶標儀（BioTek Instruments ELX808）、恒溫培養箱（精宏GNP- 9270）、電熱恒溫水浴鍋（精宏DK-8D）

實驗方法。

（1）樣品處理：稱取1g（ml）樣品（精確至0.001g），加40 ml的無菌蒸餾水溶解，放于50 ml帶蓋離心管中，于95℃水浴鍋保溫30min，期間至少搖晃4- 5次。迅速放于4℃冰箱冷卻至30℃以下，用無菌注射器吸取樣品過濾0.45μm濾膜，取所需樣品于2 ml離心管，稀釋至所需倍數。

（2）制備標準溶液：表1為標準溶液的稀釋梯度。按照說明書向B12標準品干粉的小瓶內加入適量無菌水，混勻。按表1順序加無菌水、標準品和測定用培養基于2ml EP管，一式3份。測定培養基按照說明書加10ml無菌水，搖勻，95℃水浴5 min，期間振蕩至少5次，迅速放于4℃冰箱冷卻至30℃以下，用0.45um濾膜過濾待用。

（3）樣品檢測：取出所需微孔板條固定于板上，先加150ul培養基至各微孔中，然后依次加150 ul的標準品和樣品至各微孔中，一式三份。用粘合箔蓋住板條和微孔，用手將粘合箔平壓，使其充分封閉微孔板條。

（4）培養：3 7℃黑暗條件下培育44h- 48h。

（5）測定：將微孔板倒置桌面上，振蕩，使微生物溶解于培養基中。然后將微孔板翻回前置于桌面上，從對角線方向輕扯下粘合箔，務必另一只手按壓放置在桌面上的微孔板，以防止粘合過緊撕扯帶起微孔板。用酶標儀630nm條件下讀取數值。

結果與分析

繪制標準曲線：以維生素B12含量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。如圖1，試劑盒標準曲線在0.03- 0.18ug/100g范圍內線性均良好，相關系數為1，檢測限可達到0.03ug/100g

重復性：選取配方乳粉（2份）、配方米粉、含乳飲料、功能飲料為試驗樣品，每個樣品作6次平行試驗，測試結果見表2，5種樣品6次平行測試的RSD在3.9%- 6.9%之間，說明重復性良好。

加標回收率：選擇已知維生素B12含量的標準品加入同一乳粉中，加標量分別為250.0ng，150.0ng，100.0ng，進行3次重復試驗，結果如表3，回收率為94.2%- 100.8%，試驗靈敏度較高。

小結與討論

應用微生物法檢測維生素B12，其準確度與靈敏度取決于試驗中乳桿菌數量、活力、培養基、樣品處理方式以及人員操作等因素。商品化試劑盒通過一定工藝水平將菌株固定在微孔板上，減少菌株活力、培養基等造成的誤差，但操作中仍需要注意，1.標準曲線的繪制直接影響實驗結果，因為微生物生長是非線性的，隨著VB12濃度增加，吸光度的增長漸緩慢；2.使用Ridawin數據處理軟件，采用多項式曲線擬合法繪制標準曲線更符合菌株的實際生長情況；3.需無菌操作，移液器槍頭、離心管、過濾膜等需提前滅菌，以避免外來微生物的污染。本文采用微孔板法測試5種食品添加的VB12，定量限在0.03- 0.18ug/100g（ml）范圍內線性良好，相關系數為1，重復性試驗中，樣品的平行性較好，相對標準偏差在3.9% - 6.9%，加標回收率在94.2% -100.8%，相對繁瑣的國標方法，微孔板法是一種操作簡單、快捷、準確度和重復性良好，適合各實驗室推廣應用。