小鼠頜骨發育過程中DMP1基因相關lncRNA的表達研究

夏昕 阮毅 陳絳媛 孔祥波 伍虹

【摘要】 目的? ?研究C57小鼠不同發育時期頜骨中DMP1基因附近長鏈非編碼RNA（lncRNA）的表達變化情況。 方法? ?利用lncRNA測序技術和實時定量PCR（RT?PCR）檢測孕18 d（E18D）及出生后2周（2W）的C57小鼠下頜骨組織樣本中DMP1基因位置附近的lncRNA表達變化，分析其與DMP1基因表達變化的關系。 結果? ?E18D組與2W組間有6 617條差異表達的lncRNA（∣log2 （2W/E18D）∣>1且控制錯誤發現率<0.01），其中有5條lncRNA在DMP1基因上游或下游300 000 bp以內。RT?PCR分析顯示，2W組中DMP1和lnc19450的表達較E18D組降低，而lnc30219、lnc8292、lnc30219和lnc32865的表達較E18D組上升（P均<0.05）。結論? ?lnc19450的表達與DMP1基因的表達趨勢一致，lnc30219、lnc8292、lnc30219和lnc32865的表達與DMP1基因的表達趨勢相反，推測lnc19450、 lnc30219、lnc8292、lnc30219和lnc32865可能在DMP1基因的表達調控起著重要的作用。

【關鍵詞】? 長鏈非編碼核糖核酸;牙本質基質蛋白1基因;小鼠頜骨發育

【Abstract】 Objective? ?To analyze the changes in the expression of long non?coding RNA （1ncRNA） adjacent to the DMP1 gene in different developmental stages of jawbone in C57 mice. Methods? ?The lncRNA sequencing and quantitative real?time PCR （RT?PCR） were performed to detect the expression profile of DMP1 gene?related lncRNAs at the embryonic day 18 （E18D） and 2 weeks after birth （2W） in the jawbone of C57 mice，and analyze the relationship between lncRNA expression and the changes in the expression of DMP1. Results? ?Compared with the E18D group，6 617 lncRNAs were differentially expressed in the 2W group （∣log2 （2W/E18D）∣>1 and FDR<0.01），among which，5 lncRNAs were at the upstream or downstream of DMP1 gene position within 300 kb. RT?PCRdemonstrated that the expression levels of DMP1 and lnc19450 in the 2W group were lower than those in the E18D group，whereas the expression levels of lnc30219，lnc8292，lnc30219 and lnc32865 were higher compared with those in the E18D group （all P<0.05）. Conclusions? ?The expression trends of lnc19450 and DMP1 are consistent，whereas the expression patterns of lnc30219，lnc8292，lnc30219 and lnc32865 are opposite with that of DMP1 gene，suggesting that lnc19450，lnc30219，lnc8292，lnc30219 and lnc32865 may play a vital role in regulating the expression of DMP1 gene.

【Key words】 Long non?coding RNA;DMP1 gene;Mouse jawbone development

長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類轉錄本長度超過200 nt的RNA分子，不編碼蛋白，在生物體重要生命活動中發揮著極廣泛的調控作用[1?3]。lncRNA 的功能多樣，最重要的作用是參與基因表達的調節。目前研究表明，lncRNA可以在啟動子區通過順式作用元件（啟動子或增強子）或反式作用因子（各種DNA結合因子）調控相關基因的表達[4?5]。牙本質基質蛋白1（DMP1）是骨和牙本質特異性蛋白，在牙和頜骨的分化、成熟過程以及正確調節骨和牙本質的礦化中具有復雜而重要的作用[6?7]。DMP1基因的正常表達是骨和牙齒正常發育、鈣化、干細胞向骨和牙本質分化以及正常的礦物質代謝的基礎[8?9]。因此，研究DMP1基因表達調控的變化具有重要意義。本研究利用lncRNA測序技術和實時定量PCR（RT?PCR）檢測孕18 d（E18D）及出生后2周（2W）的C57小鼠下頜骨組織樣本中DMP1基因位置附近的lncRNA的表達變化，并分析它們與DMP1基因表達的趨勢。

材料與方法

一、實驗動物

孕18 d以及出生后2周的C57小鼠，體質量10～15 g，購自中山大學動物實驗中心，飼養于中山大學（大學城）實驗動物中心，飼養環境為室溫20～22℃、12 h光照?黑暗循環，動物可自由取食及飲水。本研究的所有操作均遵守中山大學動物實驗倫理規定。

二、主要試劑及儀器

Trizol提取液和RT?PCR試劑盒均購自日本Takara公司;引物由上海生工合成;Nanodrop2000購自美國Thermo Fisher Scientific公司;RT?PCR儀（ABI Stepone Plus）購自美國Applied Biosystems公司;lncRNA?seq高通量基因測序儀（Illumina HiSeqTM2000）購自美國Illumina公司。

三、方 法

1. 取 材

取2只日齡為14 d的雄性C57小鼠與6只日齡為16 d的雌性C57小鼠分別合籠（雄∶雌=1∶3），次日通過觀察雌鼠陰道栓情況確定是否受孕，受孕小鼠定義為孕1 d，以此精確記錄懷孕時間獲得E18D C57小鼠。對E18D（3只）以及2W（4只）小鼠逐只稱重，按體質量0.01 ml/g腹腔注射5%水合氯醛麻醉小鼠，麻醉后的小鼠固定于干冰解剖臺上，于顯微鏡下解剖分離完整下頜骨組織，液氮速凍，保存于?80 ℃冰箱。取材完成后，采用頸部脫臼法處死小鼠，按實驗動物死亡處理方式處理，麻醉及后續處理方法參考文獻[10]。

2. 總RNA抽提

取適量（50～100 mg）小鼠下頜骨組織樣本，用研缽在液氮環境下研磨，按照試劑盒說明書步驟，分別抽提E18D及2W小鼠的下頜骨組織總RNA。對提取得到的RNA通過Nanodrop2000測定光密度值以及瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，檢測合格后，其中一部分送基迪奧生物進行lncRNA?Seq高通量基因測序分析，剩余部分用于后續的RT?PCR驗證分析。

3. lncRNA測序數據分析

采用Illumina HiSeqTM 2000進行測序，對下機數據去除掉質量不合格的堿基序列及核糖體RNA，將得到的非編碼序列與Ensemble基因組數據庫進行比對。測序結果的統計分析基于泊松分布模型，根據lncRNA的表達量（RPKM值）計算該lncRNA在E18D組和2W組中的差異表達倍數[log2 （2W/E18D）]，對差異檢驗的P值作多重假設檢驗校正，通過控制錯誤發現率（FDR）決定P值的域值，其中∣log2 （2W/E18D）∣>1且FDR<0.01的lncRNA為差異表達的lncRNA。

4. RT?PCR

對E18D組和2W組樣本中的DMP1基因以及在DMP1基因附近（300 000 bp以內）差異表達的lncRNA進行RT?PCR分析。取2 μg總RNA按照逆轉錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent Kit步驟完成逆轉錄，取2 μl逆轉錄產物使用SYBR Green qPCR SuperMix反應體系，在ABI Stepone Plus系統上進行RT?PCR擴增，引物序列見表1。反應條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 32 s，40 個循環。 PCR產物的特異性根據熔解曲線判定，融解曲線分析溫度60 ～ 95 ℃。基因的相對表達量采用2?ΔΔCt法分析，內參基因為GAPDH，E18D組的目標基因表達設置為1。每個樣品均平行做3個復孔。

四、統計學處理

使用SPSS 22.0進行統計分析。E18D組與2W組的基因相對表達量以x±s表示，組間比較采用t檢驗。P <0.05為差異有統計學意義。

結果

一、E18D組和2W組中差異表達lncRNA的分析

通過lncRNA測序技術在E18D組和2W組中共鑒定到38 566條lncRNA，其中6 617條在E18D組和2W組樣本中差異表達，其中RPKME18D>RPKM2W共3 720條，RPKME18D

二、DMP1基因附近差異表達lncRNA的分析

對6 617條小鼠頜骨不同發育時期差異表達的lncRNA在基因組的位置以及其相對DMP1基因（5號染色體，104202613?104214102，Ensemble數據庫編號為ENSMOSG00000029370）的距離進行分析，在DMP1基因附近獲得5條差異表達的lncRNA，見表2。其中lnc30219和lnc17290在DMP1基因的上游，而lnc19450、lnc8282和lnc32865在DMP1基因的下游，lnc19450距離DMP1基因最近，為16 505 bp。

三、E18D組和2W組中DMP1及其基因附近5條lncRNA的RT?PCR分析

DMP1基因在2W組相對表達水平低于E18D組（P<0.05）。E18D與2W組間差異表達且位于DMP1基因附近的5條lncRNA中，lnc19450在2W組中相對E18D組的表達水平下降，lnc30219、lnc8292、lnc30219和lnc32865在2W組中相對E18D組的表達水平上升（P均<0.05），其中lnc32865相對表達水平最高，見圖1、表3。

討論

lncRNA在生物體重要生命活動中發揮極廣泛的調控作用[9]。大多數的lncRNA在組織分化發育過程中，具有明顯的時空表達特異性、組織或細胞特異性[11]。目前對于在頜骨發育過程中起著重要作用的lncRNA未見報道，為了篩選出在小鼠頜骨不同發育時期差異表達的lncRNA，我們采用E18D和2W的C57小鼠下頜骨組織為研究材料，利用Illumina HiSeqTM2000平臺的lncRNA測序技術在E18D組和2W組樣本中，共檢測出38 566條lncRNA。通過差異表達倍數（2倍及以上）和多重假設檢驗校正（FDR<0.01）分析，共獲得6 617條在E18D組和2W組樣本中差異表達的lncRNA，其中RPKME18D>RPKM2W共3 720條，RPKME18D

lncRNA 可以通過多種方式調節基因的轉錄，如通過表觀遺傳修飾途徑包括組蛋白修飾（乙酰化、甲基化等）方式或DNA甲基化等調控基因的表達水平[12?13]。lncRNA 也可以作用于啟動子、轉錄因子，抑制下游蛋白質基因的表達;抑制目的基因轉錄，轉錄干擾等在基因轉錄水平進行調控[14?16]。DMP1在牙和頜骨的分化、成熟過程以及正確調節骨和牙本質的礦化中具有復雜而重要的作用，骨細胞中DMP1基因表達的時空特異性可能受非編碼區的順式調節區調控[17]。lncRNA具有時空表達特異性，并可以通過順式作用元件調節機制調控目的基因的表達。為了篩選出可能通過順式作用元件調節機制參與調控DMP1基因表達的lncRNA，本研究對6 617條lncRNA在基因組的位置以及其相對DMP1基因的距離進行初步分析，在距離DMP1基因300 000 bp以內區域獲得5條差異表達lncRNA，分別為lnc19450、lnc30219、lnc8292、lnc30219和lnc?32865，其中lnc19450距離DMP1基因最近。為了對lncRNA測序的結果進行驗證，本研究采用RT?PCR對DMP1基因以及5條lncRNA在E18D組和2W組樣本中的表達水平進行分析。在2W組中，DMP1基因的表達水平相比E18D組降低，這一結果也與已經發表的文獻報道一致[18?20]。E18D組與2W組中5條lncRNA的表達水平比較差異均有統計學意義，與lncRNA測序結果一致。lnc19450的表達與DMP1基因的表達趨勢一致，而lnc30219、lnc8292、lnc30219和lnc32865的表達在2W組中上升，與DMP1基因的表達趨勢相反，其中lnc32865相對表達水平最高。由此推測，lnc19450、 lnc30219、lnc8292、lnc30219和lnc32865可能在DMP1基因的表達調控中起著重要的作用，其中距離DMP1基因較近的lnc19450和相對表達水平較高的lnc32865可能與DMP1的關系較為密切。上述研究結果為進一步闡明lncRNA調控DMP1基因表達的分子機制提供了基礎，在后續實驗中，我們將運用過表達或小干擾RNA沉默技術，闡明相應lncRNA在過表達或抑制后DMP1的表達情況，探討lncRNA19450或lncRNA32865對DMP1的mRNA表達的調控作用以及成骨細胞礦化作用的影響，再通過RNA結合蛋白免疫沉淀、凝膠遷移實驗和啟動子雙熒光素實驗等分析手段，揭示lncRNA19450或lncRNA32865是否通過結合DMP1基因的啟動子區形成組蛋白修飾復合物的分子機制調控DMP1基因的表達，從而明確其在頜骨發育過程中的作用及相關作用機制。

參 考 文 獻

[1] Bassett AR，Akhtar A，Barlow DP，Bird AP，Brockdorff N，Duboule D，Ephrussi A，Ferguson?Smith AC，Gingeras TR，Haerty W，Higgs DR，Miska EA，Ponting CP.Considerations when investigating lncRNA function in vivo.Elife，2014，3：e03058.

[2] Tuo YL，Li XM，Luo J. Long noncoding RNA UCA1 modulates breast cancer cell growth and apoptosis through decreasing tumor suppressive miR?143.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2015，19（18）：3403?3411.

[3] Zhao W，An Y，Liang Y，Xie XW. Role of HOTAIR long noncoding RNA in metastatic progression of lung cancer. Eur Rev Med Pharmacol Sci，2014，18（13）：1930?1936.

[4] Marchese FP，Raimondi I，Huarte M.The multidimensional mechanisms of long noncoding RNA function.Genome Biol，2017，18（1）：206.

[5] Long Y，Wang X，Youmans DT，Cech TR. How do lncRNAs regulate transcription？? Sci Adv，2017，3（9）：eaao2110.

[6] Ravindran S，George A.Dentin matrix proteins in bone tissue engineering. Adv Exp Med Biol，2015，881：129?142.

[7] Jing B，Zhang C，Liu X，Zhou L，Liu J，Yao Y，Yu J，Weng Y，Pan M，Liu J，Wang Z，Sun Y，Sun YE. Glycosylation of dentin matrix protein 1 is a novel key element for astrocyte maturation and BBB integrity.Protein Cell，2018，9（3）：298?309.

[8] Sun Y，Lu Y，Chen L，Gao T，D'Souza R，Feng JQ，Qin C.DMP1 processing is essential to dentin and jaw formation.J Dent Res，2011，90（5）：619?624.

[9] Liao Q，Liu C，Yuan X，Kang S，Miao R，Xiao H，Zhao G，Luo H，Bu D，Zhao H，Skogerb? G，Wu Z，Zhao Y. Large?scale prediction of long non?coding RNA functions in a coding?non?coding gene co?expression network.Nucleic Acids Res，2011，39（9）：3864?3878.

[10] 鄧鵬輝，黃傳君，趙方正，宮曉丹，李春曉，張才擎. TGF?β1、VEGF在哮喘小鼠的表達及細辛腦的干預作用. 新醫學，2018，49（1）：25?29.

[11] Ponting CP，Oliver PL，Reik W. Evolution and functions of long noncoding RNAs. Cell，2009，136（4）：629?641.

[12] Schmitz SU，Grote P，Herrmann BG. Mechanisms of long noncoding RNA function in development and disease. Cell Mol Life Sci，2016，73（13）：2491?2509.

[13] Spadaro PA，Flavell CR，Widagdo J，Ratnu VS，Troup M，Ragan C，Mattick JS，Bredy TW. Long noncoding RNA?directed epigenetic regulation of gene expression is associated with anxiety?like behavior in mice.Biol Psychiatry，2015，78（12）：848?859.

[14] Terashima M，Tange S，Ishimura A，Suzuki T. MEG3 long noncoding RNA contributes to the epigenetic regulation of epithelial?mesenchymal transition in lung cancer cell lines. J Biol Chem，2017，292（1）：82?99.

[15] Wang Y，Zhong H，Xie X，Chen CY，Huang D，Shen L，Zhang H，Chen ZW，Zeng G. Long noncoding RNA derived from CD244 signaling epigenetically controls CD8+ T?cell immune responses in tuberculosis infection.Proc Natl Acad Sci U S A，2015，112（29）：E3883?E3892.

[16] Ding G，Li W，Liu J，Zeng Y，Mao C，Kang Y，Shang J. LncRNA GHET1 activated by H3K27 acetylation promotes cell tumorigenesis through regulating ATF1 in hepatocellular carcinoma.Biomed Pharmacother，2017，94：326?331.

[17] Thotakura SR，Karthikeyan N，Smith T，Liu K，George A.Cloning and characterization of rat dentin matrix protein 1 （DMP1） gene and its 5'?upstream region. J Biol Chem，2000，275（14）：10272?10277.

[18] Chen S，Chen L，Jahangiri A，Chen B，Wu Y，Chuang HH，Qin C，MacDougall M. Expression and processing of small integrin?binding ligand N?linked glycoproteins in mouse odontoblastic cells. Arch Oral Biol，2008，53（9）：879?889.

[19] Mashhadi Abbas F，Sichani Fallahi H，Khoshzaban A，Mahdavi N，Bagheri SS. Expression of odontogenic genes in human bone marrow mesenchymal stem cells. Cell J，2013，15（2）：136?141.

[20] Kamiya N，Takagi M. Differential expression of dentin matrix protein 1，type I collagen and osteocalcin genes in rat developing mandibular bone. Histochem J，2001，33（9?10）：545?552.

（收稿日期：2018?10?22）

（本文編輯：林燕薇）