下調SRGN基因表達對乳腺癌細胞凋亡及JAK/STAT信號通路的影響

馬劍鋒，張艷彩，孫慧

鄭州市第七人民醫院1普外科，2實驗室，鄭州4500003河南省人民醫院呼吸內科，鄭州450000

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，近些年該病在中國的發病率呈上升趨勢，成為威脅女性健康的主要惡性腫瘤[1]。乳腺癌的發生發展是一個涉及多基因、多階段的復雜過程，已有大量研究表明抑癌基因失活、癌基因激活影響乳腺癌的發生發展。因此，研究乳腺癌中抑癌基因及癌基因的表達情況，并研究其作用機制，對于乳腺癌的臨床及分子靶向治療具有重要意義。研究發現，小分子糖蛋白絲甘蛋白聚糖（serglycin，SRGN）的表達與癌細胞的侵襲和轉移有關，SRGN可以促進乳腺癌細胞的侵襲及轉移，抑制SRGN的表達可以降低乳腺癌細胞的侵襲及轉移能力[2-3]，但關于SRGN對乳腺癌細胞凋亡的影響及機制尚未清楚。因此，本研究通過RNA干擾技術沉默乳腺癌細胞中SRGN的表達，旨在研究其對乳腺癌細胞凋亡的影響，并研究其可能的分子機制，為乳腺癌的治療提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

正常乳腺上皮細胞MCF-10A及乳腺癌細胞MDA-MB-231、SMMC-7721、MCF7、HCC1569均購自美國模式菌種收集中心（ATCC）；胎牛血清、RPMI1640培養基、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒、膜聯蛋白V-FITC（Annexin V-FITC）/碘化丙錠（PI）細胞凋亡試劑盒均購自碧云天生物技術研究所；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，cleaved caspase 3）、磷酸化的蛋白酪氨酸激酶2（phosphorylated Janus kinase 2，p-JAK2）、磷酸化的信號轉導與轉錄因子3（phosphorylated signal transducers and activators of transcription 3，p-STAT3）抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將細胞置于水浴鍋中，37℃解凍后，加入RPMI1640培養基（含有10%胎牛血清），置于體積分數為5%CO2、飽和濕度為95%的培養箱中培養。采用生長至對數期的細胞進行實驗。

1.2.2 Western blot檢測SRGN蛋白的表達水平取出培養瓶中融合度超過90%的細胞，采用預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞，于培養皿中每106個細胞加入裂解液100 μ（lRIPA∶PMSF=100∶1），冰上裂解30 min，離心，上清液即為總蛋白。采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，每孔道加入總蛋白50 μg，行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE），電泳的初始電壓為60 V，30 min后將電壓調整至110 V，于溴酚藍遷移至分離膠下緣1 cm時結束電泳，整個過程約2 h。電轉移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）后，采用5%的脫脂奶粉封閉過夜，置于水平搖床中，4℃孵育一抗過夜，SRGN及內參GAPDH抗體分別按照1∶500和1∶1000稀釋，洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（1∶10000稀釋），置于水平搖床中，室溫下孵育1 h，洗膜，在化學發光凝膠成像儀上進行拍照分析。

1.2.3SRGNsiRNA轉染MDA-MB-231細胞 將MDA-MB-231細胞接種于6孔板中，培養24 h，待細胞生長達70%～80%融合時進行轉染，將SRGNsiRNA（siRNA-SRGN組）及陰性對照siRNA-Con（siRNA-Con組）經脂質體LipofectamineTM2000轉染至MDA-MB-231細胞，僅加入脂質體的為空白對照組，培養4 h后換成完全培養基，收集轉染48 h的細胞，采用Western blot檢測各組細胞中SRGN蛋白的表達水平。

1.2.4 流式細胞術檢測各組細胞的凋亡率 收集轉染48 h的各組細胞，加入預冷的PBS洗滌細胞，胰酶消化細胞，調整細胞密度為5×105/ml，加入結合緩沖液 500 μl懸浮細胞，避光，于冰上加入 5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI稀釋液，充分混勻后避光室溫培養10 min，再加入冷卻的400 μl結合緩沖液，1 h內采用流式細胞儀進行細胞計數，觀察并比較各組細胞的凋亡率。實驗重復3次。

1.2.5 凋亡蛋白及JAK/STAT信號通路蛋白表達水平的檢測 凋亡蛋白cleaved caspase 3及JAK/STAT信號通路蛋白p-JAK2和p-STAT3表達水平的檢測參照1.2.2方法。

1.3 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件對-數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SRGN蛋白在乳腺癌細胞及正常乳腺上皮細胞中的表達水平

Western blot檢測結果顯示，正常乳腺上皮細胞MCF-10A及乳腺癌細胞MDA-MB-231、SMMC-7721、MCF7、HCC1569中SRGN蛋白的表達水平分別為（0.096±0.011）、（0.526±0.057）、（0.312±0.038）、（0.488±0.052）、（0.301±0.029），5 種細胞中SRGN蛋白的表達水平比較，差異有統計學意義（F=53.043，P＜0.01）。乳腺癌細胞MDA-MB-231、SMMC-7721、MCF7、HCC1569中SRGN蛋白的表達水平均高于正常乳腺上皮細胞MCF-10A，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（圖1）

圖1 SRGN在乳腺癌細胞及正常乳腺上皮細胞中的表達

2.2 轉染SRGN siRNA對MDA-MB-231細胞中SRGN蛋白表達水平的影響

SRGNsiRNA轉染MDA-MB-231細胞48 h，Western blot檢測結果顯示，空白對照組、siRNACon組和siRNA-SRGN組中SRGN蛋白的表達水平分別為（0.337±0.042）、（0.316±0.040）、（0.087±0.010），3組比較，差異有統計學意義（F=49.963，P＜0.01）。siRNA-SRGN組的SRGN蛋白表達水平低于空白對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），siRNA-Con組和空白對照組的SRGN蛋白表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（圖2）

圖2 轉染SRGN siRNA對MDA-MB-231細胞中SRGN蛋白表達水平的影響

2.3 轉染SRGN siRNA對MDA-MB-231細胞凋亡的影響

空白對照組、siRNA-Con組和siRNA-SRGN組的細胞凋亡率分別為（2.20±0.32）%、（2.28±0.38）%、（11.16±1.22）%，3組比較，差異有統計學意義（F=137.571，P＜0.01）。與空白對照組比較，siRNA-SRGN組的細胞凋亡率升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。（圖3）

圖3 轉染SRGN siRNA對MDA-MB-231細胞凋亡的影響

2.4 轉染SRGN siRNA對凋亡蛋白及JAK/STAT信號通路蛋白表達水平的影響

空白對照組、siRNA-Con組和siRNA-SRGN組的cleaved caspase 3蛋白表達水平分別為（0.037±0.007）、（0.048±0.008）、（0.125±0.012），p-JAK2蛋白表達水平分別為（0.189±0.020）、（0.192±0.022）、（0.044±0.010），p-STAT3蛋白表達水平分別為（0.147±0.013）、（0.156±0.015）、（0.028±0.006），3組的cleaved caspase 3、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達水平比較，差異均有統計學意義（F1=80.510、F2=65.454、F3=106.835，P＜0.01）。與空白對照組比較，siRNA-SRGN組的cleaved caspase 3蛋白表達水平升高，p-JAK2和p-STAT3蛋白表達水平均下降，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（圖4）

3 討論

圖4 轉染SRGN siRNA對凋亡蛋白及JAK/STAT信號通路蛋白表達水平的影響

近年來乳腺癌基因的研究成為熱點，已有多個分子標志物應用于乳腺癌的臨床診斷及治療，但仍需發現更多的基因治療靶點。SRGN屬于小分子蛋白聚糖家族中的一員，可存在于細胞內，也可存在于細胞外，主要在內皮細胞、一些腫瘤細胞及胚胎干細胞中表達[4-6]。有研究發現，SRGN的表達與腫瘤的形成及轉移密切相關，鼻咽癌細胞中SRGN的表達可促進癌細胞轉移及上皮間質轉化樣改變[7]；SRGN在急性髓系白血病中的表達升高與腫瘤形成有關[8]；乳腺癌細胞中SRGN的表達升高，可提高腫瘤細胞的轉移及侵襲能力[2-3]，然而SRGN對乳腺癌細胞凋亡的影響尚未清楚。

本研究采用Western blot檢測正常乳腺上皮細胞和不同乳腺癌細胞中SRGN蛋白的表達水平，結果發現乳腺癌細胞中SRGN蛋白的表達水平高于正常乳腺上皮細胞，由于SRGN在乳腺癌細胞MDA-MB-231中的表達水平最高，因此被選擇作為本實驗的研究對象。RNA干擾技術是近些年來發展起來的可使基因在轉染后發生沉默的技術，具有特異性和高效性，在腫瘤治療及基因功能研究等領域廣泛應用[9-10]。本研究通過RNA干擾技術沉默MDA-MB-231細胞中SRGN的表達，并采用流式細胞術檢測細胞凋亡率，結果發現，抑制SRGN的表達可使MDA-MB-231細胞的凋亡率升高。細胞凋亡受到Caspases家族影響，caspase 3是Caspases家族中的關鍵酶，位于級聯反應的下游，生理條件下caspase 3以無活性的酶原形式在哺乳動物細胞及組織中存在，當有凋亡刺激時被活化，活化的caspase 3可導致細胞凋亡的不可逆[11-12]。目前caspase 3已作為包括乳腺癌細胞在內的多種細胞凋亡的檢測[13-14]。本研究結果顯示，SRGN表達受抑制后cleaved caspase 3的表達升高，提示SRGN促進乳腺癌細胞凋亡可能是通過上調cleaved caspase 3的表達實現。JAK/STAT信號通路參與細胞的增殖、凋亡、遷移、分化及免疫調節等生理過程，在多種腫瘤細胞中處于激活狀態[15-16]。有研究表明，JAK/STAT信號通路對于乳腺癌細胞的增殖及凋亡具有重要作用，抑制該信號通路可抑制癌細胞的發生及發展[17]。本研究發現，抑制SRGN的表達可抑制JAK/STAT信號通路中p-JAK2和p-STAT3蛋白的表達，提示SRGN可正向調控JAK/STAT信號，誘導乳腺癌細胞凋亡。

綜上所述，SRGN在乳腺癌細胞中的表達升高，通過RNA干擾抑制其表達后可誘導癌細胞凋亡，并下調JAK/STAT信號通路蛋白的表達水平，其誘導細胞凋亡的方式是上調cleaved caspase 3的表達。本研究為深入探討乳腺癌的發病機制奠定了一定的基礎，提示SRGN可能成為乳腺癌的分子診斷及治療靶點。但本研究內容有限，且未在體內試驗中驗證，因此尚需進一步研究。

[1]Neophytou CM,Constantinou C,Papageorgis P,et al.D-alpha-tocopheryl polyethylene glycol succinate(TPGS)induces cell cycle arrest and apoptosis selectively in Survivinoverexpressing breast cancer cells[J].Biochem Pharmacol,2014,89(1):31-42.

[2]Roy A,Femel J,Huijbers EJ,et al.Targeting serglycin prevents metastasis in murine mammary carcinoma[J].PLoS One,2016,11(5):e0156151.

[3]張志杰,鄧印根,尹江,等.miR-181b/c靶向調控SRGN抑制乳腺癌細胞侵襲轉移[J].中國醫師雜志,2014,16(9):1164-1167;1171.

[4]Reine TM,Vuong TT,Jenssen TG,et al.Serglycin secretion is part of the inflammatory response in activated primary human endothelial cells in vitro[J].Biochim Biophys Acta,2014,1840(8):2498-2505.

[5]Roy A,Attarha S,Weishaupt H,et al.Serglycin as a potential biomarker for glioma:association of serglycin expression,extent of mast cell recruitment and glioblastoma progression[J].Oncotarget,2017,8(15):24815-24827.

[6]Purushothaman A,Bandari SK,Chandrashekar DS,et al.Chondroitin sulfate proteoglycan serglycin influences protein cargo loading and functions of tumor-derived exosomes[J].Oncotarget,2017,8(43):73723-737732.

[7]Chia CS,Ong WS,Li XJ,et al.Serglycin expression:an independent marker of distant metastases in nasopharyngeal carcinoma[J].Head Neck,2016,38(1):21-28.

[8]Purushothaman A,Toole BP.Serglycin proteoglycan is required for multiple myeloma cell adhesion,in vivo growth,and vascularization[J].J Biol Chem,2014,289(9):5499-5509.

[9]樊蓓,李紅霞,吳玉梅,等.小分子干擾RNA抑制TNC基因的表達并逆轉卵巢癌紫杉醇耐藥[J].癌癥進展,2017,15(7):749-753.

[10]Li-Byarlay H,Li Y,Stroud H,et al.RNA interference knockdown of DNA methyl-transferase 3 affects gene alternative splicing in the honey bee[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2013,110(31):12750-12755.

[11]任吉祥,劉爽,孫洋,等.新型腫瘤抑素對C6神經膠質瘤細胞抑制作用的影響[J].中國老年學雜志,2016,36(19):4705-4706.

[12]Wu R,Tang S,Wang M,et al.MicroRNA-497 induces apoptosis and suppresses proliferation via the Bcl-2/Bax-Caspase9-Caspase3 pathway and cyclin D2 protein in HUVECs[J].PLoS One,2016,11(12):e0167052.

[13]Xie X,Hu Y,Xu L,et al.The role of miR-125b-mitochondria-caspase-3 pathway in doxorubicin resistance and therapy in human breast cancer[J].Tumour Biol,2015,36(9):7185-7194.

[14]劉寧,譚文成,夏吉生,等.miR-34a靶向MMP-13調控大鼠軟骨細胞凋亡的機制[J].暨南大學學報(自然科學與醫學版),2016,37(2):139-145.

[15]Kowshik J,Baba AB,Giri H,et al.Astaxanthin inhibits JAK/STAT-3 signaling to abrogate cell proliferation,invasion and angiogenesis in a hamster model of oral cancer[J].PLoS One,2014,9(10):e109114.

[16]Hu Y,Hong Y,Xu Y J,et al.Inhibition of the JAK/STAT pathway with ruxolitinib overcomes cisplatin resistance in non-small-cell lung cancer NSCLC[J].Apoptosis,2014,19(11):1627-1636.

[17]Slattery ML,Lundgreen A,Hines LM,et al.Genetic variation in the JAK/STAT/SOCS signaling pathway influences breast cancer-specific mortality through interaction with cigarette smoking and use of aspirin/NSAIDs:the Breast Cancer Health Disparities Study[J].Breast Cancer Res Treat,2014,147(1):145-158.