γ干擾素基因多態性與鼻咽癌易感性的分析

謝晴晴， 歐陽博慧， 李 恩， 畢忠平， 朱勝波， 唐 健， 孫一帆

（1.廣西中醫藥大學第三附屬醫院 柳州市中醫醫院檢驗科，廣西 柳州 545001 ；2.廣西醫科大學附屬柳鐵中心醫院檢驗科，廣西 柳州 545007 ）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我國南方及東南沿海一帶常見的惡性腫瘤。迄今為止，NPC的發病機制尚未完全明了。目前，多認為NPC是一種涉及多個基因之間或基因與環境之間交互作用的多基因遺傳病。γ干擾素（interferon gamma，IFN-γ）是病毒感染機體后，由細胞分泌的具有抗病毒功能的宿主特異性糖蛋白，可激活單核吞噬細胞殺傷微生物，通過激活細胞毒性T淋巴細胞殺傷感染的靶細胞。已有研究發現IFN-γ基因多態性和腫瘤的發生相關[1-2]，但目前未見關于IFN-γ基因多態性與NPC易感性相關性的報道。我們研究了最常見的IFN-γ基因多態性位點rs2430561（+874T/A）和rs1861494（+2109A/G）與NPC易感性的關系。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2014年4月—2016年4月在柳州市中醫醫院腫瘤科就診的NPC患者（病例組）共150例，其中男126例、女24例，年齡（47.28±9.58）歲。所有患者均行鼻咽鏡檢查，病理診斷明確。另選取柳州市中醫醫院體檢科體檢健康者150名作為對照組，其中男130名、女20名，年齡（49.03±11.28）歲，且年齡、性別比例與病例組相匹配。本研究遵循倫理學原則，所有研究對象自愿參加，均已知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取 抽取研究對象乙二胺四乙酸二鈉抗凝靜脈血2.0 mL，按照常規酚氯仿方法提取DNA，紫外分光光度計（美國Nano Dropzooc公司）檢測DNA質與量，合格后作為擴增模板置-20 ℃保存。

1.2.2 基因分型 +874T/A位點采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）-序列特異引物技術（sequence-specif i c primer，SSP），+2109A/G位點采用PCR-限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）進行分型。引物由生工生物工程（上海）有限公司代為合成。見表1。

表1 各檢測位點的引物和限制性內切酶

+874T/A位點PCR擴增總體積為15.0 μL，其中Dream Taq Green PCR Master Mix（2×）7.5 μL，上、下游引物各0.6 μL，內參上、下游引物各0.15 μL，DNA模板2.0 μL，滅菌去離子水4.0 μL。反應條件為：95 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，循環10次，再94 ℃變性30 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，循環23次，最后72 ℃延伸5 min。+2109A/G位點PCR擴增總體積為20.0 μL，其中Dream Taq Green PCR Master Mix（2×）10.0 μL，上、下游引物各1.06 μL， DNA模板1.0 μL，滅菌去離子水7.0 μL。反應條件為：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環35次，72 ℃延伸10 min。

PCR擴增后，+2109A/G用MspI限制性內切酶進行酶切，酶切后配制2.0%的瓊脂糖凝膠，吸取5 μL擴增產物和50 bp Marker上樣電泳，電泳條件為100 V電壓，時間為65 min，銀染法進行結果的觀察和判讀，凝膠成像儀拍照分析。+874T/A位點擴增后電泳圖即為最終基因分型圖。

1.3 各位點基因測序分型鑒定

病例組和對照組隨機抽取20%的PCR擴增產物，送交生工生物工程（上海）有限公司進行測序，測序結果采用DNAMAN軟件進行比對，測序圖譜采用DNAMAN軟件進行識別。

1.4 統計學方法

采用SPSS 12.0軟件進行數據分析。病例組和對照組各SNP位點基因型和等位基因頻率比較采用χ2檢驗；用Logistic回歸分析校正年齡、性別等混雜因素，計算相應的比值比（odds ratio，OR）及其95%可信區間（confidence interval，CI）。統計檢驗使用雙側概率檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。采用χ2檢驗分析各SNP位點基因型頻率的分布是否符合HWE平衡，符合HWE平衡時P＞0.05。

2 結果

2.1 基因分型結果

+874位點野生基因型為TT，在電泳圖上可見加了上游引物1（含特異堿基T）的擴增管在303 bp處有條帶出現，而加入了上游引物2（含特異堿基A）的擴增管在303 bp處無條帶出現；突變基因型AA與之相反；雜合子TA 2管都有條帶出現。內參對照帶為400 bp，每管都必須有內參對照條帶出現，見圖1（a）。直接測序結果驗證基因分型結果完全正確[圖1（b）]。

圖1 病例組和對照組基因分型結果

+2109位點酶切序列為G，酶切片段分別有22、245、267 bp。由于22 bp片段太小，電泳后跑出了凝膠。故電泳圖根據如下判讀：（1）1條帶267 bp，表示不能切開，為AA基因型；（2）1條帶245 bp，表示完全切開，為GG基因型；（3）2條帶245和267 bp，表示部分切開，為AG基因型。+2109位點PCR擴增產物酶切后結果見圖1（c）。直接測序結果驗證基因分型結果完全正確[圖1（d）]。

2.2 +874T/A位點基因型及等位基因型與NPC易感性的關系

+874位點病例組和對照組各基因型實際頻率與預計頻率相比，差異無統計學意義（χ2=2.926，P=0.087），符合HWE平衡。以AA基因型為參考，將病例組與對照組進行比較，并利用Logistic回歸分析校正性別和年齡因素。病例組與對照組比較（TT與AA）：OR=0.132，95%CI=0.022～0.800，P=0.028。等位基因T與A比較，經校正病例組與對照組比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。+874T/A位點各基因模式比較患病風險及95%CI見表2。

2.3 +2109A/G位點基因型及等位基因型與NPC易感性的關系

+2109位點病例組和對照組各基因型實際頻率與預計頻率相比，差異無統計學意義（χ2=2.926，P=0.370），病例組和對照組標本符合HWE平衡。以AA基因型為參考，將病例組與對照組進行比較，并利用Logistic回歸分析校正性別和年齡因素。各基因模型比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。等位基因G與野生型A比較，經校正后的結果差異均無統計學意義（P＞0.05）。+2109A/G位點基因模式比較患病風險及95%CI見表2。

表2 各位點基因型及等位基因型頻率與NPC易感性的關系

3 討論

IFN-γ作為一種關鍵的細胞因子，其基因多態性在癌癥的發病過程中發揮了一定的作用。本研究結果顯示，病例組與對照組比較，IFN-γ基因+874位點野生基因型TT患病風險是突變基因型AA的0.132倍（95%CI=0.022～0.800，P=0.028）。因此，IFN-γ基因+874位點TT基因型是廣西地區慢性肝炎的保護基因。已有研究發現在高危人乳頭瘤病毒感染患者IFN-γ基因+874位點基因分布頻率中AA基因型是TT基因型的4倍，AA基因攜帶者感染人乳頭瘤病毒的概率是TT基因攜帶者的1.7倍，因此AA基因型可能會影響女性人乳頭瘤病毒感染的自我清除，是宮頸癌發生的一個風險因素[3-4]。相反，T基因由于可以促進IFN-γ的高表達，可能在癌癥發生中起到了保護作用，如T基因攜帶者食管癌的發生概率較其他基因型低[5]。此外，IFN-γ基因+874位點基因多態性還和卵巢癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、結腸癌的患病風險相關[6]。

IFN-γ基因多態性能通過以下途徑導致癌癥的發生：（1）乙型肝炎病毒感染是肝癌發生的主要因素之一，IFN-γ基因+874位點AA基因型的IFN-γ產量最低，陳永琴等[7]發現IFN-γ水平與乙型肝炎病毒清除力相關，IFN-γ水平越高，乙型肝炎病毒DNA載量越低[7]；此外，突變會影響IFN-γ與細胞表面干擾素受體的結合，也導致病毒清除能力下降，使癌癥風險增加[8]。（2）IFN-γ基因+874位點是核轉錄因子結合點，其基因多態性通過在轉錄水平影響這一信號通路，導致氧自由基損害，從而導致癌癥的發生[8]。（3）IFN-γ產量的下降也會影響雙鏈RNA依賴蛋白質激酶、死亡受體、腫瘤壞死因子α受體在細胞表面的表達，使細胞分化增殖和凋亡調控受到干擾，容易導致癌癥的發生[9]。

IFN-γ基因+2109位點和+874位點一樣，都是核轉錄因子結合點，其基因多態性能通過在轉錄水平影響這一信號通路，導致氧自由基損害，從而導致肝硬化和肝纖維化的發生[8]。本研究將病例組與對照組相比較，進行患病風險的各種基因模型比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。因此，本研究結果表明IFN-γ基因+2109位點基因多態性與廣西地區NPC患病風險無關。

不同的研究可以發現IFN-γ基因+874位點和+2109位點基因多態性與疾病易感性也不同。比如來自巴西的研究認為，+874位點A基因攜帶者發生肝癌的風險與TT基因型相比更低[10-11]，存在這種差別的主要原因是由于廣西地區人群A基因突變率明顯高于巴西人群，野生型TT基因型顯著偏低。本研究結果表明，廣西地區IFN-γ基因+874位點以純合突變AA基因型為主，其次為雜合子AT，而野生型純合子TT最少，所占比例也非常低。我們的研究與2009年藍艷等[12]在廣西調查的結果一致，與武漢[13]的研究結果也無顯著差別，但與河北[14]、山東[15]和溫州[16]的結果存在明顯差別。

總之，本研究結果提示IFN-γ +874位點基因多態性與NPC易感性相關聯，但還需多種族和更大的樣本量的研究來進行驗證。

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