黃芩素對多西他賽體外抗前列腺癌活性的影響

應 曉， 王育瑛， 王再紅， 王振華

（1.衢州市中醫醫院檢驗科，浙江 衢州 324002；2.杭州市中醫院檢驗科，浙江 杭州 310007）

在各類癌癥中，前列腺癌是男性群體中發病率和死亡率都很高的惡性腫瘤，嚴重威脅男性健康[1]。對于早期的前列腺癌患者而言，手術和放療是目前最有效的治療方法，然而對于中晚期前列腺癌患者而言，化療是必不可少的治療手段[2]。多西他賽是用于前列腺癌治療的一線化療藥物[3]。然而，由于腫瘤細胞的耐藥性，有相當比例的前列腺癌患者對多西他賽治療不敏感[4-5]，因此尋找輔助治療藥物以降低前列腺癌細胞對多西他賽的抵抗性，提高其治療效果，具有十分重要的意義。黃芩素是從天然藥物黃芩根部提取的主要活性成分，具有抗過敏、抗菌、抗病毒的功效。近期有研究結果顯示黃芩素有一定的腫瘤抑制作用，如黃芩素能通過抑制蛋白38（protein 38，p38）信號通路的活化抑制胃癌的侵襲轉移，能靶向于前列腺癌細胞中的小窩蛋白-1/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白通路，抑制其生長和轉移[6-7]。但黃芩素是否對前列腺癌的化療有輔助治療作用仍不清楚。有研究結果顯示，將化療藥物與一些天然藥物活性成分進行聯合治療能降低腫瘤細胞對化療藥物的抵抗性，有效提高化療藥物的療效[8-9]。因此，本研究探討了黃芩素對多西他賽體外抗前列腺癌活性的影響和機制。

1 材料和方法

1.1 試劑來源

多西他賽、噻唑藍[3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]、黃芩素、二甲亞砜和Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自德國Sigma-Aldrich公司。Dulbecco改良Eagle培養基（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM）購自美國Gibco公司。細胞蛋白提取液、JC-1線粒體膜電位染料和線粒體分離試劑盒購自江蘇碧云天生物科技有限公司。TRIzol試劑和逆轉錄試劑盒購自美國Invitrogen公司。鼠雙微體2 （murine double minute 2，MDM2）、蛋白53（protein 53，p53）、受p53基因上調表達的凋亡調控基因（p53 upregulated modulator of apoptosis，Puma）、佛波醇-12-肉豆酸酯-13-乙酰基誘導蛋白1（phorbol-12-myriistate-13-acetate-induced protein 1，PMAIP1，又稱Noxa）、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（cysteine-containing aspartatespecific protease，Caspase）-9、Caspase-3和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體購自美國Cell Signaling公司。增強型化學發光底物（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒購自美國Pierce公司。SYBR Green試劑盒購自大連TaKaRa公司。

1.2 細胞培養

人前列腺癌細胞系LNCaP購于美國模式培養物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC）。LNCaP細胞用含10%胎牛血清的DMEM在37 °C、5% CO2恒溫培養箱中培養。

1.3 MDM2過表達質粒的構建和轉染

人MDM2基因的開放閱讀框架全長序列經聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增后以分子克隆的方法與pcDNA3.1連接，構建成MDM2重組過表達質粒。MDM2過表達質粒采用脂質體2000進行轉染，簡要步驟如下：將2 μg/mL質粒用脂質體2000包裹后加入到無血清培養基中進行混合，將貼壁生長的LNCaP細胞置于該無血清培養基孵育6 h，棄去無血清培養基并加入新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養24 h。嚴格按試劑說明書進行操作。

1.4 方法

1.4.1 分組 將LNCaP細胞接種在96孔板（5×103/孔）上，按不同處理方式分為對照組、黃芩素組、多西他賽組、多西他賽+黃芩素組和多西他賽+黃芩素+MDM2質粒組。（1）對照組：空質粒轉染的LNCaP細胞不加藥物培養48 h；（2）多西他賽組：在空質粒轉染的LNCaP細胞中加入1 nmol/L多西他賽培養48 h；（3）黃芩素組：在空質粒轉染的LNCaP細胞中加入10 μmol/L黃芩素培養48 h；（4）多西他賽+黃芩素組：在空質粒轉染的LNCaP細胞中加入1 nmol/L多西他賽和10 μmol/L黃芩素培養48 h；（5）多西他賽+黃芩素+MDM2質粒組：在MDM2質粒轉染的LNCaP細胞中加入1 nmol/L多西他賽和10 μmol/L黃芩素培養48 h。

1.4.2 細胞活力檢測 各組處理完畢后在各培養孔中加入20 μL 5 mg/mL MTT再培養4 h，小心吸去上清液，往培養孔中加入150 μL 二甲亞砜，充分震蕩后在570 nm波長下用Sunrise Microplate Reader酶標儀 （瑞士TECAN公司）檢測吸光度（A）值。LNCaP細胞活力抑制率計算公式：抑制率=（A值對照組-A值藥物處理組）/A值對照組×100%。

1.4.3 細胞凋亡實驗 將LNCaP細胞按2×106/孔接種在6孔板上，按上述分組處理完畢后將細胞用Annexin V染色孵育20 min，采用流式細胞術檢測LNCaP細胞的凋亡，凋亡率用Annexin V陽性細胞數占總細胞數的百分比表示。嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.4.4 線粒體膜電位測定 將LNCaP細胞按2×106/孔接種在6孔板上，按上述分組處理完畢后將細胞用JC-1染料孵育20 min，孵育完畢后用流式細胞儀檢測紅色熒光，紅色熒光強度越強，線粒體膜電位越高[10]。各處理組的相對線粒體膜電位由各處理組與對照組的紅色熒光強度比值表示。嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.4.5 熒光定量PCR 將LNCaP細胞按2×106/孔接種在6孔板上，按上述分組進行處理。LNCaP細胞總RNA用Trizol試劑提取。cDNA采用逆轉錄試劑盒由總RNA合成。MDM2基因采用SYBR Green試劑盒進行定量PCR擴增，以GAPDH為內參，MDM2基因的相對表達量用2-△△CT法計算。嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.4.6 免疫印跡法 將LNCaP細胞按2×106/孔接種在6孔板上，按上述分組處理完畢后用蛋白提取液提取細胞總蛋白并用12.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離。分離完畢后通過電轉方法將蛋白質由分離膠轉移到醋酸纖維素膜上，用MDM2、p53、Puma、Noxa、Caspase-9、Caspase-3、細胞色素c和GAPDH抗體孵育過夜，再用帶辣根過氧化物酶的二抗孵育2 h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發光。嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.4.7 線粒體分離 為了檢測細胞色素c從線粒體釋放到胞質中的水平，需除去LNCaP細胞的線粒體。將LNCaP細胞按2×106/孔接種在6孔板上，按上述分組處理完畢后用線粒體分離試劑盒將細胞的線粒體從胞質中分離。檢測胞質中的細胞色素c蛋白水平，無線粒體的胞質中的細胞色素c蛋白水平越高，說明線粒體的細胞色素c的釋放水平越高。嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.5 統計學方法

采用SPSS 16.0軟件進行統計分析。所有實驗均重復3次。呈正態分布的數據采用表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 黃芩素對多西他賽抗LNCaP細胞活性的影響

多西他賽+黃芩素組對LNCaP細胞活力的抑制率和LNCaP細胞凋亡率明顯高于多西他賽+黃芩素+MDM2質粒組、多西他賽組、黃芩素組及對照組（P＜0.05），多西他賽組、多西他賽+黃芩素+MDM2質粒組明顯高于黃芩素組及對照組（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 各組LNCaP細胞的活力抑制率和凋亡率比較（%，±s ）

表1 各組LNCaP細胞的活力抑制率和凋亡率比較（%，±s ）

注： 與對照組比較，*P＜0.05；與黃芩素組比較，#P＜0.05；與多西他賽+黃芩素組比較，△P＜0.05

組別 細胞活力抑制率 凋亡率對照組 0 1.5±0.2黃芩素組 8.8±0.7 4.5±0.5多西他賽組 19.8±1.6*#△ 10.6±0.8*#△多西他賽+黃芩素組 68.6±6.3*# 38.1±3.3*#多西他賽+黃芩素+MDM2質粒組27.9±2.4*#△ 14.6±1.3*#△

2.2 黃芩素對LNCaP細胞表達MDM2的影響

黃芩素組和多西他賽+黃芩素組LNCaP細胞MDM2 mRNA和MDM2蛋白水平均低于多西他賽+黃芩素+MDM2質粒組、多西他賽組和對照組（P＜0.05），而黃芩素組與多西他賽+黃芩素組之間、多西他賽組與對照組之間MDM2 mRNA和MDM2蛋白水平差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖2、圖3。

圖1 各組LNCaP細胞的凋亡率比較

2.3 黃芩素對多西他賽誘導的凋亡信號的影響

圖2 黃芩素和多西他賽對LNCaP細胞MDM2 mRNA表達的影響

圖3 黃芩素和多西他賽對LNCaP細胞MDM2蛋白表達的影響

多西他賽+黃芩素組p53蛋白水平、Puma蛋白水平、Noxa蛋白水平、細胞色素c釋放水平及Caspase-9、Caspase-3活化水平均高于多西他賽+黃芩素+MDM2質粒組、多西他賽組、黃芩素組和對照組（P＜0.05），而相對粒體膜電位則低于其他各組（P＜0.05）；多西他賽+黃芩素+MDM2質粒組、多西他賽組、黃芩素組和對照組之間各項指標差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖4～圖6。

圖4 黃芩素和多西他賽對p53依賴的凋亡相關蛋白表達的影響

圖5 多西他賽和黃芩素對LNCaP細胞線粒體膜電位的影響

圖6 黃芩素和多西他賽對LNCaP細胞Caspase-9、Caspase-3活化及細胞色素c釋放的影響

3 討論

多西他賽屬于紫杉烷類化療藥物，能誘導前列腺癌、肺癌和乳腺癌等多種腫瘤細胞發生凋亡性死亡。在前列腺癌的治療中，以多西他賽為代表的紫杉烷類化療藥物是目前治療前列腺癌的一線治療藥物。這些藥物能抑制腫瘤細胞骨架的合成，從而阻止其發生細胞分裂和增殖[11-13]。然而，在化療過程中，常常會出現腫瘤細胞對多西他賽耐藥。天然藥物活性成分黃芩素具有一定的抗腫瘤活性，并且毒性較低，但黃芩素是否能提高前列腺癌細胞對多西他賽治療的敏感性至今還不清楚。本研究預實驗結果顯示黃芩素單獨治療對LNCaP細胞的殺傷活性較弱，其半抑制濃度達到265 μmol/L，因此本研究嘗試探討低濃度黃芩素（10 μmol/L）對多西他賽化療是否有協同效應。本研究結果顯示黃芩素聯合多西他賽處理能顯著提高LNCaP細胞的活力抑制率和凋亡率，表明黃芩素是一種良好的化療輔助治療藥物，能顯著提高LNCaP細胞對多西他賽誘導的凋亡作用的敏感性。

野生型p53是一種重要的腫瘤抑制分子，能通過促進下游靶基因，如Puma和Noxa[14]的表達，誘導腫瘤細胞發生凋亡。然而，在多種腫瘤細胞中，p53基因會發生表達缺失或發生突變，使p53蛋白喪失對腫瘤的抑制作用。盡管如此，在多數前列腺癌細胞中，p53仍以野生型的形式存在并發揮抗腫瘤活性[15]。因此，在前列腺癌的治療中，p53是一個潛在的重要靶點。在一般情況下，p53蛋白的穩定性和活性受MDM2蛋白的調控，細胞中的MDM2蛋白能與p53結合，從而抑制p53的生物活性并誘導其發生降解。因此，前列腺癌細胞中的p53蛋白水平會維持在一個較低水平。當前列腺癌細胞處于化療藥物作用下時，p53蛋白能從MDM2-p53復合物中游離出來，從而增加其穩定性和細胞內的水平[16-17]。由此可見，前列腺癌細胞中的p53蛋白水平受細胞中MDM2蛋白和化療藥物的調控。本研究結果顯示，當LNCaP細胞單獨用多西他賽處理時，細胞中的p53蛋白水平稍有升高；當用黃芩素和多西他賽聯合處理時，LNCaP細胞中的p53蛋白水平明顯升高。當LNCaP細胞轉染MDM2質粒，使MDM2在LNCaP細胞中強制表達后，細胞中的p53蛋白水平明顯下降，對LNCaP細胞活力的抑制率和LNCaP細胞凋亡率明顯降低，表明黃芩素和多西他賽的協同抗前列腺癌活性受到了明顯抑制。由此可見，黃芩素是通過抑制LNCaP細胞中MDM2的表達，間接增強了多西他賽對p53蛋白的活化，由此促進了多西他賽的抗前列腺癌活性。

Puma和Noxa是MDM2/p53信號通路的下游蛋白。本研究結果顯示黃芩素與多西他賽聯合處理能明顯上調LNCaP細胞中Puma和Noxa蛋白的表達。同時，還發現黃芩素能明顯促進多西他賽對LNCaP細胞線粒體途徑凋亡的誘導，使細胞線粒體膜電位發生改變，促使線粒體發生腫脹，釋放其中的凋亡活性物質細胞色素c，從而使凋亡執行蛋白Caspase-9和Caspase-3發生活化，最終導致細胞凋亡的發生。

綜上所述，黃芩素能通過MDM2/p53途徑提高多西他賽的體外抗前列腺癌活性，為增強多西他賽的化療療效提供了新的思路和理論依據。

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