循環(huán)腫瘤DNA在非小細胞肺癌療效評估中的意義

孫云鳳, 楊　欣, 方　成, 趙偉慶, 季　枚

(蘇州大學第三附屬醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科, 江蘇 常州, 213000)

由于人口的增長和老齡化，癌癥的發(fā)生量也在不斷增加。其中肺癌的發(fā)病率及死亡率逐年上升[1-2]。目前居中國癌癥死亡原因首位的肺癌，已經(jīng)占到全部惡腫瘤死亡總數(shù)的22.7%。目前，肺癌的治療的療效評估主要參照影像學RESIST 1.1標準。此外，腫瘤指標CEA、CA 9-9等傳統(tǒng)腫瘤指標也作為一個參考指標，但其敏感性不高。循環(huán)腫瘤DNA是指腫瘤細胞體細胞DNA通過脫落或者細胞凋亡釋放入循環(huán)系統(tǒng)，攜帶一定特征的DNA片段。ctDNA用于預后評估及療效評估在乳腺癌[3]、結(jié)直腸癌[4]、淋巴瘤[5]等腫瘤中均有研究。本研究采用熒光PCR法檢測樣本總DNA量、完整DNA量及甲基化DNA拷貝數(shù); 收集患者的影像學資料及臨床資料，探討ctDNA是否較傳統(tǒng)腫瘤指標CEA、CA 9-9在非小細胞肺癌療效評估具有更高的敏感性，現(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1　一般資料

選取2016年7月—2018年1月在蘇州大學第三附屬醫(yī)院住院治療(包括化療、靶向治療)的局部晚期及晚期非小細胞肺癌患者。納入標準: ① 原發(fā)性非小細胞肺癌; ② 系經(jīng)組織病理確診; ③ PS評分為0或者1; ④ 實驗室檢查: 肝、腎功能正常; ⑤ 具有完善的治療前后的各臨床指標。排除標準: ① 患者患有嚴重的系統(tǒng)性疾病和/或急、慢性感染性疾病; ② 嚴重的心、肝、腎等臟器疾病; ③ 有精神系統(tǒng)疾病患者。分組情況: 按照影像學RECIST 1.1標準評估療效，分為進展組和有效組(CR+PR+SD)。

1.2　主要試劑及儀器設備

QIAamp DNA Blood Mini kit試劑盒[凱杰企業(yè)管理(上海)有限公司(Qiagen)]; EZ DNA Methylation-Gold Kit試劑盒(北京天漠科技開發(fā)有限公司); 基因引物(金唯智生物科技有限公司); mastermix聚合酶(近岸蛋白質(zhì)科技有限公司); 恒溫水箱(常州朗越儀器制造有限公司); 恒溫金屬浴(朗越儀器制造有限公司); 4 ℃冰箱(青島海爾股份有限公司); -20 ℃冰箱(青島海爾股份有限公司); 臺式高速冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司); 臺式常溫離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司); 振蕩器(金壇市白塔新寶儀器廠); ABI熒光定量PCR儀-7500型[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]; 生物安全柜(上海鼎科科學儀器有限公司); 超凈工作臺(上海鼎科科學儀器有限公司); 循環(huán)變溫器(浙江新豐醫(yī)療器械有限公司)。

1.3　實驗方法

1.3.1血液樣本DNA提取: 采用QIAamp DNA Blood Mini kit法。取2 mL的離心管，加入20 μL的蛋白酶K; 再加入200 μL血漿后混勻; 再加200 μL Buffer AL 于上述離心管底，混勻，振蕩15 s; 隨后在56 ℃水箱中放置10 min; 取出離心管，短暫離心5 s; 加200 μL無水乙醇于上述混合液中，振蕩15 s混勻，短暫離心; 完成后，在QIAamp柱子中加入上述混合液，然后將柱子放在2 mL收集管中，蓋上蓋子，將之放入離心機中以8 000 轉(zhuǎn)/min離心1 min; 離心后，丟去原先的收集管，放入一個干凈的收集管中，打開QIAamp柱子，加入500 μL Buffer AW1于柱子中，蓋上蓋子，將之放入離心機中，以8 000 轉(zhuǎn)/min離心1 min; 然后丟去用過的收集管，放入一個新的干凈的收集管中，打開QIAamp柱子，加500 μL Buffer AW2于柱子中，蓋上蓋子，將之放入離心機中，以14 000 轉(zhuǎn)/min離心3 min; 丟去離心后的收集管，將柱子套在一個新的收集柱中，以14 000 轉(zhuǎn)/min離心3 min后，將柱子取出，打開蓋子，室溫干燥; 待乙醇完全蒸發(fā)后，將柱子套在一個1.5 mL的干凈的離心管中，加入40 μL Buffer AE 于柱子底部，靜置5 min后放入離心機中，以10 000 轉(zhuǎn)/min離心3 min。提取出的DNA備用。

1.3.2DNA甲基化處理: 采用EZ DNA Methylation-Gold Kit試劑盒法。在500 μL PCR管中添加130 μL的CT conversion Reagent，然后再加入提取備用的20 μL DNA樣品，通過輕彈試管或移液器操作來混合樣品; 將樣品管放到循環(huán)變溫器中, 98 ℃放置10 min, 64 ℃放置2.5 h, 在Zymo-Spin IC Column中加600 μL M-binding Buffer, 并將柱子放入試劑盒提供的收集管中; 添加PCR管中的混合液到上述加有M-binding Buffer的Zymo-Spin IC Column中，蓋上蓋子，反復顛倒柱子以充分混勻樣品，然后將柱子放入離心機中，以10 000 轉(zhuǎn)/min離心1 min; 棄除掉柱中的廢液，添加100 μL M-Wash Buffer于柱子底部，以10 000 轉(zhuǎn)/min全速離心1 min; 棄除掉柱中的廢液，在柱子底部添加200 μL M-Desulphonation Buffer, 在室溫(20～30 ℃) 下放置15～20 min, 隨后以10 000 轉(zhuǎn)/min全速離心1 min; 棄掉柱中的廢液，添加200 μL M-Wash Buffer于柱子底部，以10 000 轉(zhuǎn)/min全速離心1 min; 棄掉柱中的廢液，再加200 μL M-Wash Buffer于柱子底部，以10 000 轉(zhuǎn)/min全速離心1 min; 將柱子套在1.5 mL離心管中，添加30 μL M-Elution Buffer于柱子中，以10 000 轉(zhuǎn)/min全速離心1 min來洗脫DNA，隨后進行DNA分析。

1.3.3總DNA及完整DNA計算(PCR): 使用已知拷貝數(shù)為N1的DNA樣本，經(jīng)過Ct1個PCR擴增循環(huán)，到達設定閾值，然后使用同樣的方法，處理需檢測樣本中的拷貝數(shù)N2, 經(jīng)過Ct2個循環(huán)達到同樣的閾值，根據(jù)下述公式，計算得出樣本的總DNA及完整DNA的拷貝數(shù)。N2=N1×2Ct1-Ct2。

1.3.4甲基化DNA拷貝數(shù)計算(PCR): 計算方法及原理同總DNA、完整DNA。

1.4　統(tǒng)計學處理

統(tǒng)計學處理采用SPSS 22.0軟件進行分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。GraphPad Prism 5.0軟件作圖。

2　結(jié)　果

2.1　一般資料

48例非小細胞肺癌患者中女14例(29.17%), 男34例(70.83%), 年齡42～79歲，中位年齡63歲; 48例NSCLC患者中包含腺癌40例(83.33%), 鱗癌6例(12.50%), 細支氣管肺泡癌1例(2.08%), 腺鱗癌1例(2.08%); Ⅳ期患者42例, Ⅲ期6例; CT評估OR 30例, PD 18例; CEA降低32例，升高16例; CA 19-9降低35例，升高13例; ctDNA評估治療獲益25例，評估為有進展可能23例。見表1。

表1　患者一般資料

2.2　ctDNA、CEA與CA 19-9評估療效的敏感性 比較

分別使用CT、ctDNA、CEA、CA 19-9評估療效，若CEA數(shù)值較前降低，且CT評估為OR, 表示CEA與CT評估一致。若ctDNA評估進展, CT評估PD表示兩者評估結(jié)果一致。

ctDNA與CT評估一致的患者23例(47.92%), CEA與CT評估一致的患者26例(54.17%), CEA與CT的一致率較ctDNA高，但二者無顯著差異(P=0.540)。見圖1。ctDNA與CT評估一致的患者23例(47.92%), CA 19-9與CT評估一致的患者31例(64.58%), CA 19-9與CT的一致率較ctDNA高，但二者無顯著差異(P=0.100)。見圖2。CEA與CT評估一致的患者26例(54.17%), CA 19-9與CT評估一致的患者31例(64.58%), CA 19-9與CT的一致率較CEA高，但二者無顯著差異(P=0.299)。見圖3。

圖1　ctDNA、CEA與CT評估的一致性

圖2　ctDNA與CA19-9與CT評估的一致性

圖3　CEA、CA19-9與CT評估的一致性

3　討　論

肺癌的高發(fā)病率與高致死率已經(jīng)嚴重威脅到人類的健康。由于早期肺癌患者臨床癥狀特異性不強，大部分肺癌患者確診時癌細胞已發(fā)生了轉(zhuǎn)移，導致患者的總體生存期短。肺癌的轉(zhuǎn)移過程相當復雜，其主要轉(zhuǎn)移途徑有種植性轉(zhuǎn)移、直接浸潤、淋巴道轉(zhuǎn)移及血行轉(zhuǎn)移。血行轉(zhuǎn)移是肺癌轉(zhuǎn)移的首要路徑，然而其轉(zhuǎn)移效率較低，在經(jīng)過一系列轉(zhuǎn)移過程后，最終只有約0.01%的腫瘤細胞在血液循環(huán)得以存活，最后形成轉(zhuǎn)移灶。

隨著對肺癌的不斷研究，針對肺癌的治療方法不斷增多，抗血管生成藥物、分子靶向藥物、免疫治療等方法的臨床應用，使得肺癌患者無疾病進展期明顯延長，但是患者的5年生存率仍然較低[6]。目前腫瘤的早期診斷及療效評估主要依據(jù)影像學變化及腫瘤指標。血清腫瘤標志物是診斷腫瘤的無創(chuàng)性檢測手段，廣泛用于腫瘤的篩查、治療效果及患者的預后評估。然而，其特異性及敏感性欠佳，不能滿足臨床要求。CEA診斷肺癌的敏感性僅有40%[7], 其在肺癌中的預測、預后價值仍有爭議[8]。本研究通過熒光定量PCR法對NSCLC患者治療前及治療后的血漿中的ctDNA進行檢測，以CT為參考標準，進一步與傳統(tǒng)肺癌血清腫瘤標志物CEA、CA 19-9對NSCLC治療療效價值進行比較。

本研究結(jié)果顯示, CEA、CA19-9、ctDNA均有一定的療效預測作用，但敏感性不高，且ctDNA在評估治療療效上其并不優(yōu)于CEA、CA 19-9, 與預期研究結(jié)果不一致?？赡芘c下述原因有關(guān): ① 在癌細胞侵襲入血的過程中，大部分的癌細胞被NK細胞吞噬，血液中殘留的循環(huán)細胞及循環(huán)DNA含量均較低，因此對檢測技術(shù)要求較高。循環(huán)中的腫瘤DNA在體內(nèi)間斷釋放，且在體內(nèi)不斷的代謝，檢測結(jié)果會因采血時間、飲食因素、個體差異及潛在的其他系統(tǒng)疾病影響。② 肺癌容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，如腦轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移、腎上腺轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。研究[9-11]認為，肺癌的甲基化與肺癌的惡性程度及預后有關(guān)，本研究中, ctDNA的評估依據(jù)總DNA、DNA完整性、甲基化DNA三者綜合評價療效，其中檢測結(jié)果中的甲基化DNA, 僅僅檢測了WT1、CDKN2A、CDH 13、SLIT 2、HOXA 9、SFRP 2、SNCA、CST 6這8個常見的基因位點，以這8個位點的甲基化數(shù)量為甲基化DNA總量，而沒有檢測其他少見甲基化突變位點。③ 目前肺癌的治療，仍然參考影像學評估，但是抗血管治療及分子靶向治療使得腫瘤發(fā)生空泡化、壞死、液化等變化，而在CT上表現(xiàn)為腫瘤病灶增大，依據(jù)影像學RECIST 1.1標準，疾病評估為進展(PD), 但實際上治療是獲益的。因此，單純的以腫瘤直徑變化來評估療效的可靠性仍有待進一步考察。④ ctDNA檢測過程復雜，步驟繁瑣，一系列操作流程稍微的誤差對最終的結(jié)果均可能有一定的影響。此外，本實驗的納入研究對象僅有48例，考慮樣本量不足，需進一步擴大樣本量。