運動聯合抗抑郁藥物對大鼠海馬細胞和BDNF/pERK信號通路的影響

（華中科技大學同濟醫學院附屬武漢精神衛生中心 精神科，湖北 武漢 430022）

抑郁癥是一種常見的心境和認知功能障礙性疾病，發病率高。維持海馬神經細胞增殖和凋亡的動態平衡有助于緩解抑郁癥的惡化。研究表明，長期缺乏運動是導致抑郁癥的主要因素之一[1]。采用運動療法治療精神疾病和腦疾病療效較好[2]。因此，本實驗研究運動聯合帕羅西汀對抑郁癥大鼠行為學、海馬細胞凋亡、氧化應激損傷的影響及其作用機制，為抑郁癥的治療提供理論依據。

1　材料與方法

1.1　主要試劑

帕羅西汀（臺州海辰藥業有限公司），膜聯蛋白V-FITC（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（propidium iodide,PI）凋亡檢測試劑盒（美國羅氏公司），活性氧（reactive oxygen species,ROS）檢測試劑盒（上海碧云天生物技術研究所），DMEM培養基、胎牛血清（fatal bovine serum,FBS）購自美國Gibco公司，腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）一抗、磷酸化細胞外信號調節激酶（phosphorylation extracellular regulated protein kinases,pERK）一抗、神經肽（Neuropeptide,VGF）一抗購自美國Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.2　方法

1.2.1大鼠抑郁模型的復制68只健康成年雄性SD大鼠由湖北省實驗動物中心提供，安靜飼養3 d后進行7 d的跑臺適應性訓練，將不愛運動的8只大鼠去掉。參照趙立波[3]和王瓏等[4]的模型復制方法，采用慢性不可預知性溫和應激（chronic unpredictable mild stress,CUMS）結合孤養法復制慢性應激抑郁模型：第1天禁食24 h，第2天夾尾3 min，第3天0℃游泳5 min，第4天水平振蕩2 min，第5天晝夜顛倒，第6天禁食24 h，第7天45℃溫箱熱烘5 min，第8天禁水24 h，第9天45℃溫箱熱烘5 min，第10天禁食24 h，第11天晝夜顛倒，第12天0℃游泳5 min，第13天水平振蕩2 min，第14天夾尾3 min，第15天禁水24 h，第16天0℃游泳5 min，第17天夾尾3 min，第18天45℃溫箱熱烘5 min，第19天晝夜顛倒，第20天禁食24 h，第21天水平振蕩2 min，將抑郁大鼠單獨飼養。模型復制結束后觀察行為學試驗作為缺乏快感的客觀指標，判定模型是否復制成功。

1.2.2實驗分組根據體重均衡的原則將實驗分為5組：對照組、模型組、運動組、給藥組、聯合組，每組12只。對照組為正常飼養的大鼠，其余均接受21 d的CUMS。模型復制同時，給藥組、聯合組大鼠每次應激前灌胃10 mg/kg帕羅西汀，對照組、運動組大鼠給予等量的生理鹽水；運動組、聯合組每天上午以轉輪跑的方式進行訓練，運動量為跑速10 m/min，30 min/次，1 次 /d[5]。

1.2.3行為學試驗①糖水實驗：應激0、7、14和21 d測量剝奪飲水24 h后大鼠1 h內的糖水消耗量，糖水的飲用量反映大鼠快感反應。②Morris水迷宮實驗：將大鼠置于Morris水迷宮中，水溫控制在24～26℃，記錄大鼠的逃避潛伏期，即在1 min內找到透明平臺的時間，循環5次/d，連續測試3 d，取平均數為大鼠空間學習記憶成績。

1.2.4流式細胞術將大鼠麻醉后斷頭取出腦組織，在冰盤上分離出右側海馬，采用酶消化法收集細胞，加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）制成單細胞懸液，調整細胞濃度為1×106個/ml。取1 ml細胞懸液，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入1 ml預冷PBS重懸細胞，重復3次，加入10μl Annexin V-FITC和5μl PI輕輕振蕩混勻，4℃避光染色20 min，采用流式細胞儀檢測4組大鼠海馬細胞凋亡率。

1.2.5DCFH-DA法采用DCFH-DA法檢測細胞中ROS的含量。細胞懸浮液的制作方法同1.2.4。培養24 h后，PBS洗滌2次，重懸使細胞濃度調整為1.5×105個/ml，取2 ml接種至6孔板上，每孔加入濃度為10μmol/L的DCFH-DA探針，37℃避光培養30 min，棄去DCFH-DA，使用無血清的培養液洗滌細胞3次，離心收集細胞，加入100μl PBS重懸細胞，檢測485/535 nm波長處的熒光值。

1.2.6Western blot檢測將應激結束后的大鼠斷頭取腦組織，冰上分理出海馬，置于液氮中迅速冷凍，放入-80℃冰箱中保存。實驗時取出海馬組織，加入組織裂解液，振蕩混勻，置于冰上裂解30 min，離心取上清，按BCA試劑盒說明書進行操作，檢測蛋白的表達水平。在蛋白樣品中加入上樣緩沖液稀釋，沸水浴5 min，根據目的蛋白配置相應濃度的分離膠和5%濃縮膠進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，待溴酚藍遷移至凝膠底部，停止電泳，經浸漬轉至硝酸纖維素膜上，用3% FBS封閉液4℃過夜，加入稀釋好的一抗，置于搖床上4℃孵育過夜，PBS緩沖液清洗3次，10 min/次，加入二抗，室溫孵育1 h，PBS緩沖液清洗3次，10 min/次，加入增強化學發光法顯色液，暗室中曝光，定影液中浸泡5 min，凝膠成像系統中測定蛋白的灰度值。以目的條帶灰度值與內參β-actin灰度值的比值為pERK、BDNF、VGF蛋白的相對表達量。

1.3　統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組比較用單因素方差分析或重復測量設計的方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1　運動聯合帕羅西汀對大鼠行為學的影響

2.1.1運動聯合帕羅西汀對各組大鼠不同時間糖水飲用量的影響對照組、模型組、運動組、給藥組、聯合組大鼠應激0、7、14和21d的糖水飲用量比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的糖水飲用量有差別（F=9.238，P=0.000）；②4組大鼠糖水飲用量有差別（F=6.932，P=0.003）；③4組糖水飲用量變化趨勢有差別（F=8.742，P=0.000）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，模型組大鼠7、14和21 d的糖水消耗量較對照組降低（t=4.405、7.214和11.135，均P=0.000），提示大鼠抑郁模型復制成功。運動組、給藥組、聯合組大鼠14和21 d的糖水消耗量較模型組增加（P＜0.05）；聯合組大鼠21 d的糖水消耗量較運動組、給藥組增加（t=2.846和2.927，P=0.009和0.008），提示運動和給藥可一定程度上增加大鼠的糖水飲用量，緩解抑郁大鼠的快感缺乏，且聯合作用效果高于單獨使用。見表1。

表1　運動聯合帕羅西汀對各組大鼠不同時間糖水飲用量的影響（n=12，g，±s）

表1　運動聯合帕羅西汀對各組大鼠不同時間糖水飲用量的影響（n=12，g，±s）

組別　0 d　7 d　14 d　21 d對照組　63.4±12.2　66.5±8.5　72.4±9.4　79.6±8.4模型組　62.7±16.4　50.1±9.7　48.6±6.5　47.5±5.4運動組　60.7±13.4　55.7±10.2　59.6±11.5　61.8±6.7給藥組　60.1±16.4　54.6±7.4　57.5±9.4　60.7±8.2聯合組　64.2±16.9　56.3±8.5　62.3±10.1　70.5±8.2

2.1.2運動聯合帕羅西汀對各組大鼠空間記憶學習的影響對照組、模型組、運動組、給藥組、聯合組大鼠應激0、7、14和21 d的大鼠空間記憶學習能力比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的逃避潛伏期有差別（F=11.291，P=0.000）；②4組大鼠逃避潛伏期有差別（F=14.357，P=0.000）；③4組大鼠逃避潛伏期變化趨勢有差別（F=9.637，P=0.000）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，模型組大鼠7、14和21 d的逃避潛伏期較對照組延長（t=6.931、9.923和14.763，均P=0.000），表明大鼠空間記憶學習增強，糖水消耗結果一致，也提示本實驗抑郁模型復制成功。運動組、給藥組大鼠21 d逃避潛伏期較模型組縮短（t=5.612和7.720，均P=0.000）；聯合組14和21 d逃避潛伏期較模型組縮短（t=14.460，P=0.000）。聯合組大鼠14和21 d逃避潛伏期較給藥組、運動組縮短（P＜0.05），提示運動和給藥在14 d后可縮短大鼠逃避潛伏期，聯合使用效果優于單獨使用。見表2。

表2　運動聯合帕羅西汀對各組大鼠不同時間逃避潛伏期的影響（n=12，s，±s）

表2　運動聯合帕羅西汀對各組大鼠不同時間逃避潛伏期的影響（n=12，s，±s）

組別　0 d　7 d　14 d　21 d對照組　33.4±6.3　28.1±5.4　23.4±4.5　20.1±5.3模型組　34.5±6.4　43.1±5.2　48.7±7.6　53.9±5.6運動組　35.4±6.2　42.3±5.2　45.2±5.3　40.0±6.5給藥組　35.4±7.1　40.4±8.3　42.1±6.2　38.3±4.2聯合組　34.2±4.5　38.4±6.5　33.4±6.3　28.3±2.5

2.2　運動聯合帕羅西汀對大鼠海馬細胞凋亡的影響

對照組、模型組、運動組、給藥組、聯合組大鼠海馬細胞凋亡率分別為（10.5±1.7）%、（48.5±6.7）%、（35.1±5.9）%、（23.6±5.7）% 和（22.6±6.1）%，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=81.300，P=0.000）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，模型組、運動組、給藥組、聯合組大鼠海馬細胞凋亡率高于對照組（t=19.044、13.879、7.629和6.619，均P=0.000）；運動組、給藥組、聯合組細胞凋亡率低于模型組（t=19.044、13.879和7.629，均P=0.000）；運動組細胞凋亡率高于給藥組（t=4.856，P=0.000）；聯合組細胞凋亡率低于運動組（t=5.102，P=0.000）。提示抑郁癥提高大鼠海馬細胞的凋亡率，運動和給藥可降低抑郁大鼠海馬細胞的凋亡率，聯合使用緩解細胞凋亡，可改善抑郁癥。見圖1。

圖1　運動聯合帕羅西汀對各組大鼠海馬細胞凋亡的影響

2.3　運動聯合帕羅西汀對大鼠海馬細胞ROS的影響

對照組、模型組、運動組、給藥組、聯合組大鼠海馬細胞ROS的相對表達量分別為（1.0±0.1）、（4.8±0.9）、（3.2±0.8）、（2.5±0.7） 和（2.3±0.4），經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=54.967，P=0.000）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，模型組、運動組、給藥組、聯合組大鼠海馬細胞ROS高于對照組（P＜0.05）；運動組、給藥組、聯合組大鼠海馬細胞ROS低于模型組（t=4.603、6.988和8.793，均P=0.000）；運動組大鼠海馬細胞ROS高于給藥組（t=2.218，P=0.033）；聯合組大鼠海馬細胞ROS低于運動組（t=3.486，P=0.002）。提示抑郁大鼠氧化損傷增加，運動和給藥可抑制氧化應激損傷，聯合治療優于單獨作用。

2.4　運動聯合帕羅西汀對大鼠海馬pERK、BDNF、VGF蛋白表達的影響

4組大鼠海馬海馬pERK、BDNF、VGF蛋白表達水平比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，模型組大鼠海馬pERK、BDNF、VGF蛋白表達水平低于對照組（t=9.798、9.798和7.349，均P=0.000）；運動組、給藥組、聯合組大鼠海馬pERK、BDNF、VGF蛋白表達水平高于模型組（P＜0.05）；運動組pERK蛋白表達水平高于給藥組（t=17.146，P=0.000），運動組BDNF、VGF蛋白表達水平低于給藥組（t=4.899和2.450，P=0.000和0.023）；聯合組pERK、BDNF、VGF蛋白表達水平高于給藥組（t=6.794、4.201和4.382，均P=0.000）；聯合組pERK、BDNF、VGF蛋白表達水平高于運動組（t=2.228、5.881和5.477，P=0.046、0.000和0.000）。提示抑郁大鼠抑制BDNF、pERK、VGF的表達，運動聯合給藥逆轉BDNF/pERK細胞信號轉導通路及其靶基因的含量優于單一運動療法或藥物治療。見圖2和表3。

表3　運動聯合帕羅西汀對各組大鼠海馬pERK、BDNF、VGF 蛋白表達的影響（n=12，±s）

表3　運動聯合帕羅西汀對各組大鼠海馬pERK、BDNF、VGF 蛋白表達的影響（n=12，±s）

組別　pERK　BDNF　VGF對照組　0.7±0.1　0.8±0.1　0.8±0.1模型組　0.3±0.1　0.4±0.1　0.5±0.1運動組　1.2±0.1　0.6±0.1　0.7±0.1給藥組　0.5±0.1　0.8±0.1　0.8±0.1聯合組　1.5±0.5　1.3±0.4　1.2±0.3F值　51.310　33.600　30.000P值　0.000　0.000　0.000

圖2　各組大鼠海馬pERK、BDNF、VGF蛋白的表達

3　討論

近年來，隨著生活水平的提高、節奏的加快，全球＞9億人患有抑郁癥，且發病率逐年升高，僅次于心臟病。目前針對抑郁癥的治療藥物一般起效較慢，有效性也不高，對于部分難治性抑郁癥更是束手無策。長期缺乏鍛煉可導致抑郁癥的發生，是抑郁癥產生的重要影響因素。有研究表明，很少從事體力勞動的人患精神疾病的概率明顯高于經常從事體力鍛煉的人[6]。臨床研究也顯示，運動對精神患者的治療和康復療效較好[7]，而且體育鍛煉結合藥物的療效遠遠高于單一藥物治療[8]，但是其作用機制尚不完全清楚。應激性事件是誘發抑郁癥的主要因素之一，應激可引起機體諸多功能障礙，如認知功能、消化功能、情緒障礙等。CUMS是近年來研究抑郁癥作用機制、藥物研發與使用等功能時最常用的抑郁動物模型之一，可模擬抑郁癥患者的快感缺失和行為絕望等核心癥狀。帕羅西汀是一種新型的抗抑郁藥物，起效快，耐受性好，能夠有效改善抑郁癥狀[9]。

本研究通過復制CUMS抑郁模型大鼠，觀察運動聯合抗抑郁藥物對大鼠行為學的影響。通過糖水Morris水迷宮實驗發現，模型組大鼠糖水消耗量降低，逃避潛伏期延長，表明抑郁大鼠模型復制成功，快感缺乏。慢性應激同時給予運動或藥物中的一種或者聯合使用可改善該核心癥狀，其中藥物聯合運動的緩解效果較好。

抑郁癥的發病機制和抗抑郁藥物的研發與細胞內信號轉導相關蛋白或者靶基因關系密切，其中BDNF是最重要的影響因子之一。BDNF通過激活酪氨酸激酶受體B和有絲分裂原激活蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase,MAPK）信號轉導級聯，影響抑郁癥的病理生理結構和細胞功能。BDNF表達量可影響海馬神經細胞的凋亡率。細胞外信號調節激酶（extracellular regulated protein kinases,ERK）是MAPKs的一個亞族，分為ERK1、ERK2、ERK3等多種亞型，其中腦組織中以ERK1、ERK2為主，統稱為ERK1/2，是MAPK信號級聯的重要蛋白之一。ERK1/2水平降低可促進抑郁癥的發生、發展。ERK磷酸化后可激活胞漿內底物和轉錄因子cAMP反應元件結合蛋白CREB，調控細胞的增殖、凋亡，以及促進下游因子BDNF的表達[10]。VGF最早是作為神經生長因子在PC12細胞中誘導的基因產物而被發現的。近年來研究證明，VGF主要通過作為BDNF的靶基而發揮抗抑郁作用[11-12]。本實驗通過流式細胞術檢測海馬細胞凋亡率和DCFH-DA法檢測ROS水平，發現CUMS抑郁模型大鼠海馬細胞ROS和凋亡率增加，運動、給藥單獨或者聯合使用均可降低細胞ROS和凋亡率，緩解氧化應激損傷；Western blot檢測發現，慢性刺激降低海馬細胞中BDNF、pERK、VGF的表達量，運動和抗抑郁藥物具有緩解BDNF、pERK、VGF表達量降低的作用，但運動聯合藥物逆轉BDNF、pERK、VGF表達量優于單一運動療法或抗抑郁藥物治療，其可能是通過運動和抗抑郁藥物增強pERK的表達，進而上調BDNF，從而調控下游靶基因VGF的水平，發揮抗抑郁效果。

總之，運動聯合抗抑郁藥物帕羅西汀能夠有效緩解慢性應激引起的抑郁癥狀，逆轉大鼠快感缺乏，降低海馬細胞凋亡率和氧化應激損傷，其作用機制可能是通過BDNF/pERK信號通路，調控下游靶基因的表達而發揮作用。