miR-106a對小鼠卵巢癌移植瘤生長的影響研究

蔡智慧，李鵬，梁義娟，石軍榮，蘇媛媛，謝丹，劉競芳

（1.河北大學附屬醫院 婦科，河北 保定 071030；2.河北大學附屬醫院 超聲科，河北 保定 071030；3.河北省保定市第一醫院 超聲科，河北 保定 071000）

卵巢癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤，患者的復發率和死亡率均較高。卵巢癌細胞增殖、侵襲能力較強，且目前尚缺乏治療卵巢癌的靶向藥物是造成卵巢癌患者預后較差的重要原因。因此，尋找卵巢癌的治療靶點對改善卵巢癌患者的預后具有積極的價值。微小RNA（MicroRNA, miRNA）是一類在細胞內發揮多種生物學作用的非編碼小分子RNA，能夠調節靶基因的轉錄和翻譯過程并影響細胞的增殖、侵襲及血管新生。miRNA-106a（miR-106a）是近年來發現的具有原癌基因特性的miRNA，能夠靶向抑制癌細胞內多種抑癌基因的表達。在惡性腫瘤的發生和發展過程中，miR-106a的高表達會抑制抑癌基因的表達并增強癌細胞的惡性生物學行為[1]。已有研究報道，miR-106a對卵巢癌細胞的體外增殖、侵襲具有促進作用[2]，但關于miR-106a對癌細胞在體條件下增殖、侵襲的影響并未明確。本研究復制小鼠卵巢癌移植瘤模型并分析瘤內注射miR-106a對卵巢癌移植瘤生長的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SKOV3卵巢癌細胞株購自中國科學院上海細胞庫，RPMI 1640培養基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自上海Hyclone公司，LipofectamineTM2000購自上海Invitrogen公司，miR-106a抑制劑、陰性對照的抑制劑由上海吉瑪公司合成，SPF級BALB/c小鼠購買自北京維通利華實驗動物技術有限公司，RNA抽提試劑盒、互補DNA（complementary DNA, cDNA）第一鏈合成試劑盒實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）試劑盒購自北京天根生物公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠卵巢癌移植瘤模型的復制 培養SKOV-3細胞，用0.125%的胰蛋白酶消化傳代，取傳代后且處于對數生長期的SKOV-3細胞，離心后用無血清培養基重懸細胞并調節密度至1×107個/ml，取0.5 ml細胞懸液并進行皮下注射，注射部位為小鼠右前肢腋窩外側，注射后7 d測量腫瘤體積，以腫瘤體積3～4 mm3判斷為模型復制成功，用于后續分組和實驗。

1.2.2 卵巢癌移植瘤小鼠的分組和干預 取卵巢癌移植瘤小鼠，隨機分為空白對照組、陰性對照組、miR-106a抑制組，每組各8只，干預方法：①空白對照組：瘤內注射100 μl生理鹽水與3 μl LipofectamineTM2000試劑的混合液；②陰性對照組：瘤內注射95 μl生理鹽水、5 μl陰性對照抑制劑、3 μl LipofectamineTM2000試劑的混合液；③miR-106a抑制組：瘤內注射95μl生理鹽水、5 μl miR-106抑制劑、3 μl LipofectamineTM2000試劑的混合液。每隔4 d注射1次，并用游標卡尺測量腫瘤的最大長徑和最大橫徑，以0.5×最大長徑×最大橫徑×最大橫徑計算腫瘤體積。

1.2.3 基因mRNA表達的檢測 干預后第40天，測量腫瘤體積后處死小鼠，解剖得到移植瘤組織后采用RNA抽提試劑盒分離組織中的總RNA，而后采用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA；取cDNA樣本進行qRT-PCR擴增，分別擴增人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10,PTEN）、磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B, PKB/AKT）、細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、生存素（Survivin）、基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2, MMP-2）、MMP-9、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、β-肌動蛋白（β-actin），以 βactin為內參照計算PTEN、PI3K、AKT、CyclinD1、Survivin、MMP-2、MMP-9、VEGF的mRNA表達。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 21.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，3組比較采用方差分析、兩兩比較采用LSD-t檢驗，多時間的比較采用重復測量設計的方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 瘤體體積的變化情況

空白對照組、陰性對照組、miR-106a抑制組干預前、干預后10、20、30和40 d時瘤體體積比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①空白對照組、陰性對照組、miR-106a抑制組之間的瘤體體積有差異（F=17.685，P=0.000）；②每組內不同時間點的瘤體體積有差異（F=13.489，P=0.000）；③各組瘤體體積變化趨勢有差異（F=16.328，P=0.000）。見表1。

2.2 腫瘤組織中PTEN、PI3K、AKT的表達

干預后40 d時，空白對照組、陰性對照組、miR-106a抑制組移植瘤小鼠腫瘤組織中PTEN、PI3K、AKT表達的分析如下：miR-106a抑制組小鼠腫瘤組織中PTEN的mRNA表達高于空白對照組和陰性對照組（P＜0.05），PI3K、AKT的mRNA表達低于空白對照組和陰性對照組（P＜0.05）。見表2。

2.3 腫瘤組織中信號通路下游分子的表達

干預后40 d時，空白對照組、陰性對照組、miR-106a抑制組移植瘤小鼠腫瘤組織中CyclinD1、Survivin、MMP-2、MMP-9、VEGF表達的分析如下：miR-106a抑制組小鼠腫瘤組織中CyclinD1、Survivin、MMP-2、MMP-9、VEGF的mRNA表達低于空白對照組和陰性對照組（P＜0.05）。見表3。

表1 3組移植瘤小鼠瘤體體積的變化情況 （n =8，mm3，±s）

表1 3組移植瘤小鼠瘤體體積的變化情況 （n =8，mm3，±s）

注：1）與空白對照組比較，P ＜0.05；2）與陰性對照組比較，P ＜0.05；3）與干預前比較，P ＜0.05；4）與干預后10 d比較，P ＜0.05；5）與干預后20 d比較，P ＜0.05；6）與干預后30 d比較，P ＜0.05

組別 干預前 干預后10 d干預后20 d干預后30 d干預后40 d miR-106a抑制組5.90±0.8246.97±6.941）2）3）92.52±10.251）2）3）4）135.65±17.851）2）3）4）5）188.42±22.461）2）3）4）5）6）陰性對照組5.98±0.91115.14±18.023）227.14±39.243）4）390.15±45.613）4）629.14±81.253）4）空白對照組5.92±0.78114.52±16.793）225.96±37.823）4）387.87±42.623）4）624.51±78.783）4）

表2 3組移植瘤小鼠腫瘤組織中PTEN、PI3K、AKT的表達 （n =8，±s）

表2 3組移植瘤小鼠腫瘤組織中PTEN、PI3K、AKT的表達 （n =8，±s）

注：?與陰性對照組和空白對照組比較，P ＜0.05

組別PTENPI3KAKT miR-106a抑制組2.65±0.39?0.38±0.09?0.41±0.08?陰性對照組1.05±0.141.06±0.171.02±0.15空白對照組1.00±0.161.00±0.121.00±0.18 F值23.95120.28512.582 P值0.0000.0000.002

表3 3組移植瘤小鼠腫瘤組織中信號通路下游分子的表達 （n =8，±s）

表3 3組移植瘤小鼠腫瘤組織中信號通路下游分子的表達 （n =8，±s）

注：?與陰性對照組和空白對照組比較，P ＜0.05

組別CyclinD1SurvivinMMP-2MMP-9VEGF miR-106a抑制組0.35±0.08?0.32±0.06?0.39±0.06?0.28±0.05?0.23±0.04?陰性對照組0.98±0.141.03±0.151.05±0.161.07±0.120.97±0.16空白對照組1.00±0.151.00±0.181.00±0.141.00±0.171.00±0.15 F值18.35221.34816.84328.68222.155 P值0.0000.0000.0000.0000.000

3 討論

卵巢癌的發病機制目前仍未明確，臨床上也缺乏治療卵巢癌的靶向藥物。miRNA是近年來新發現的一類具有廣泛生物學活性的非編碼小分子RNA，能夠與靶基因mRNA的3'-非翻譯區結合并造成mRNA降解或抑制mRNA翻譯。miR-106a是具有原癌基因活性的miRNA，已有多項研究發現，miR-106a在胃癌[3]、卵巢癌[4]、胰腺癌[5]等多種惡性腫瘤組織中呈高表達趨勢，且與癌細胞的增殖活力、侵襲活力密切相關。國內李敏等[2]的研究報道，miR-106a對卵巢癌細胞的體外增殖、侵襲具有促進作用，但是關于miR-106a對卵巢癌組織生長的影響未見報道。本研究以卵巢癌移植瘤小鼠作為研究對象，通過瘤內注射miR-106a的方式來分析卵巢癌組織中miR-106a的生物學作用，進而對腫瘤組織的生長情況進行評價，結果顯示：干預后10、20、30和40 d時，miR-106a抑制組移植瘤小鼠的瘤體體積均低于空白對照組和陰性對照組。這就說明miR-106a抑制劑對卵巢癌移植瘤的生長具有抑制作用。

miRNA發揮生物學作用主要依賴于對靶基因表達的靶向調控，miR-106a在惡性腫瘤的病情發展變化過程中起到促進作用且對多種促凋亡基因、抑癌基因的表達具有靶向抑制作用。PTEN基因是體內重要的抑癌基因之一，也是受到miR-106a調節的靶基因之一[6-7]。PTEN基因所編碼的蛋白能夠是細胞內的第二信使PIP3脫去3'-磷酸，進而影響下游PI3K/AKT信號通路的激活。在卵巢癌的發生和發展過程中，PTEN的表達減少，低表達的PTEN會造成PI3K/AKT激活并促進細胞的增殖、侵襲及血管新生。通過分析移植瘤組織中PTEN/PI3K/AKT的表達可知，miR-106a抑制組小鼠腫瘤組織中PTEN的mRNA表達高于空白對照組和陰性對照組，PI3K、AKT的mRNA表達低于空白對照組和陰性對照組。這就說明miR-106a能夠靶向調控卵巢癌組織中PTEN的表達，抑制miR-106a能夠增加PTEN的表達并抑制PI3K/AKT的激活。

PTEN所調控的PI3K/AKT信號通路具有廣泛的生物學效應，細胞的增殖、侵襲、血管新生等生物學過程均受到該信號通路的調控。PI3K發生磷酸化后能夠將底物磷脂酰肌醇4，5-二磷酸轉變為PI3P，后者能夠使AKT發生磷酸化并調節多種增殖、侵襲、血管新生相關靶基因的表達[8-9]。CyclinD1和Survivin是受到AKT調控的增殖相關基因，前者能夠與CDK4、CDK6形成復合物并加速細胞周期，后者能夠拮抗多種Caspase分子并抑制細胞凋亡；MMP-2和MMP-9是MMPs家族中受到AKT調控的成員，能夠通過降解細胞外基質的方式促進細胞侵襲；VEGF是受到AKT調控的血管新生血管基因，是目前已知促血管新生作用最強的細胞因子。本研究通過分析移植瘤組織中上述增殖、侵襲、血管新生相關靶基因的表達量可知：miR-106a抑制組小鼠腫瘤組織中CyclinD1、Survivin、MMP-2、MMP-9、VEGF的mRNA表達低于空白對照組和陰性對照組。說明miR-106a對卵巢癌組織中CyclinD1、Survivin、MMP-2、MMP-9、VEGF的表達具有調節作用，抑制miR-106a能夠減少增殖、侵襲、血管新生相關靶基因的表達。

綜上所述，miR-106a對卵巢癌組織中PTEN/PI3K/AKT通路具有靶向調節作用；瘤內注射miR-106a抑制劑能夠通過增強PTEN信號通路來抑制卵巢癌移植瘤小鼠的腫瘤生長。