DC-CIK生物治療后肺癌患者Pro-GRP和T淋巴細胞亞群對免疫功能評價的臨床意義

何麗杰，馮賀強，褚相南，呂玉洋，張賀平

（天津市第五中心醫院 檢驗科，天津 300450）

肺癌是目前世界上發病率和致死率最高的惡性腫瘤之一[1]。世界衛生組織發布的《World Cancer Report 2014》指出肺癌仍是最普遍和最致命的癌癥。在中國，隨著空氣污染等問題的日趨嚴重，每年肺癌新發病例為67.6萬，死亡病例為56.5萬，均居世界各國肺癌發病率和死亡率的第1位。由于小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）臨床上表現為高度惡性，腫瘤增長較快，早期即發生區域淋巴結轉移、復發及遠處轉移，約70%的肺癌患者在確診時已經屬于晚期，大部分患者喪失手術機會，轉而接受常規的化療、放療，而放化療的不良藥物反應和耐藥性讓很多患者難于接受。在過去的20年中，生物免疫治療被認為是一種新的“綠色療法”逐漸受到關注，其治療的原理是體外擴增效應細胞（如NK細胞、DC細胞、CIK細胞等），通過回輸效應細胞，刺激機體的免疫應答，依賴效應細胞本身的高殺傷活性及自體的免疫系統共同抗擊腫瘤細胞。DC-CIK治療被廣泛使用，因為它對多種癌癥的高增殖率和細胞毒活性，簡單而溫和的培養期，很少有不良反應且提高患者滿意度和依從性[2]。

本實驗基于DC-CIK生物治療的研究，通過收集肺癌患者未治療前和經生物治療1個月后血，監測治療前后免疫功能、腫瘤標志物等的變化，探討DC-CIK細胞治療對肺癌患者的治療效果，明確其對肺癌患者免疫功能的影響。本研究將對肺癌患者的支持治療及改善生活質量具有積極意義，可為臨床規范應用DCCIK細胞治療肺癌提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年9月-2015年8月天津市第五中心醫院就診的肺癌患者45例，其中，男性31例，女性14例；年齡43～86歲，中位數62歲。所有患者均經過病理學確診，其中小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）13例，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）32例，所有患者均為首次來院就診，均無其他免疫相關性疾病，且不合并其他惡性腫瘤，檢測前未接受過放化療及免疫治療。對照組選取同時期健康體檢者40例，其中，男性22例，女性18例；年齡56～64歲，中位數60歲。放化療、生物治療前清晨空腹采集患者肘正中靜脈血5 ml，胃泌素釋放肽前體（Pro-gastrin-releasing peptide, Pro-GRP）采用分離膠促凝管，T淋巴細胞亞群及調節性T細胞（regulatory T cell, Treg）采用EDTA-K2抗凝血，采血后立即送檢驗科4 h內檢測完畢。

1.2 儀器與試劑

電化學發光免疫分析儀Cobas E601（德國羅氏診斷有限公司），FC500流式細胞儀（美國貝克曼-庫爾特公司），血細胞分離機（美國FRESENIUS KABI公司），Pro-GRP、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）、神經元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase, NSENSE）、細胞角蛋白19的可溶性片段（cytokeratin 19 fragment, CYFRA21-1）檢測試劑盒（德國羅氏診斷有限公司）。四色淋巴細胞亞群CD45-FITC/CD4-RD1/CE8-ECD/CD3-PC5、CD45-FITC/CD56-RD1/CD19-ECD/CD3-PC5、溶血素（OptiLyse C）Flow Count計數微球、0.01 mol PBS溶液、Immuntrol質控血（美國貝克曼-庫爾特公司）。

1.3 實驗分組

生物治療前Pro-GRP、T淋巴細胞亞群分3組，即對照組、SCLC組、NSCLC組。生物治療后分兩組，即SCLC組、NSCLC組。

1.4 實驗方法

1.4.1 Pro-GRP、CEA、NSE及CYFRA21-1檢測在LIS系統輸入患者信息，受檢者外周血的Pro-GRP、CEA、NSE、CYFRA21-1按照儀器及試劑使用說明書要求上機檢測，將結果分組記錄。

1.4.2 T淋巴細胞亞群檢測 將樣本編號并錄入實驗室信息系統（LIS），準備與樣本相同數量流式細胞管并編號，在已編號流式細胞管中各加入10 μl四色抗體，渦旋混勻，室溫避光放置15～20 min；在已編號流式細胞管中用反向加樣法分別加入100 μl全血，取出試管，每管加入500 μl Opti Lyse C溶血素并立渦旋混勻2 s，20～25℃避光孵育10 min；在流式細胞管中加入500μl PBS，室溫平衡5 min；取出Flow-Count熒光微球，渦旋震蕩器勻10～12 s，以反向加樣法在各管中加入100 μl熒光微球（熒光微球的加樣量與樣本量一致），充分混勻，2 h內上機檢測；登錄至LIS并復核轉錄是否正確。

1.4.3 Treg細胞檢測 取靜脈血100 μl加入已編號流式細胞管，分別加入CD4-PE標記CD25-FITC標記的熒光單克隆抗體20 μl，渦旋混勻，室溫避光放置15～20 min，加入細胞裂解液4 ml，渦旋混勻，室溫避光放置10 min待紅細胞完裂解，離心取上清，加入2 ml PBS洗滌2次，上機檢測。

1.4.4 DC-CIK細胞生物治療 血細胞分離機循環外周血4 000～5 000 ml，采集腫瘤患者外周血，循環4次，循環血量根據患者身高、體重等而定，采集外周血35 ml，單個核細胞數大約為1×108個，采血袋酒精消毒后，于傳遞窗送入細胞制備室（百萬級GMP標準試驗間），進行密度梯度離心，無菌制備PBMC，37℃孵育2～4 h，將懸浮細胞移出，貼壁細胞中，補充有1 000 u/ml粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）和1 000 u/ml IL-4的培養基，37℃、5%二氧化碳培養箱中培養，第4天補充上述細胞因子，第6天加入攜帶多抗原Ad5型腺病毒，MOI=5，負載DC，第7天加入TNF-α，負載DC成熟，制備成DC疫苗。吸取懸浮細胞，用含INF-g的2%自體血清的完全培養基懸浮，調整細胞梯度至密度為2×106個/ml，接種于75 cm2培養瓶中，24 h后，向培養液中加入CD3單抗、重組人IL-2及重組人IL-1，誘導生成大量CIK細胞，每2天更換1次培養液，培養10～14 d后，根據細胞擴增情況，收集CIK細胞并用生理鹽水洗滌2次。然后將細胞懸浮于含有20 g/L人血清清蛋白的100 ml生理鹽水中，并靜脈輸注給患者，細胞量每次＜1×1010個，活力＜95%，每周回輸1次共回輸3次，回輸前對細胞培養液取樣進行細菌、真菌、支原體和內毒素檢測，回輸后以相同方法采集外周靜脈血檢測Pro-GRP和T淋巴細胞亞群。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用獨立樣本t檢驗，生物治療前后比較選用配對樣本t檢驗，相關性分析采用Pearson檢驗，各組數據分別服從正態分布，且方差齊性，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Pro-GRP、CEA、NSE及CYFRA21-1在肺癌中的表達

Pro-GRP在SCLC組中高表達，有時甚至可高達5 000 pg/ml，對照組與SCLC組、NSCLC與SCLC組間Pro-GRP水平比較差異有統計學意義（t=3.304和-3.290，P =0.006），對照組與NSCLC組Pro-GRP水平比較差異無統計學意義（t=-5.860，P =0.052）；Pro-GRP和NSE在SCLC組的表達高于NSCLC組，CYFRA21-1在NSCLC組的表達高于SCLC組，CEA在各組表達差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 DC-CIK生物治療前后Pro-GRP、T淋巴細胞亞群水平的比較

NSCLC組治療后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+表達增高，CD8+、Treg細胞表達降低；而SCLC組治療后CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+表達增高。Treg細胞表達降低；兩組治療后的Pro-GRP水平與治療前比較，差異有統計學意義（P ＜0.05），均低于治療前。見表2。

2.3 DC-CIK生物治療前后兩組T淋巴細胞亞群的變化

DC-CIK細胞生物治療后NSCLC組CD8+淋巴細胞和Treg細胞較治療前降低，CD3+、CD4+淋巴細胞、CD4+/CD8+比值較治療前上升；SCLC組CD3+、CD4+、CD8+淋巴細胞數量較治療前均增加，Treg細胞兩組均較治療前降低。見圖1～5。

2.4 DC-CIK生物治療前后Pro-GRP與T淋巴細胞亞群相關性分析

SCLC組Pro-GRP治療前與CD3+、CD4+、CD8+、呈負相關，與Treg細胞呈正相關，治療后也存在相關性（P＜0.05）；在NSCLC組Pro-GRP與CD3+、CD4+、CD8+無相關，只與Treg細胞呈正相關。見表3。

表1 各組肺癌患者血清腫瘤標志物檢測水平的比較 （±s）

表1 各組肺癌患者血清腫瘤標志物檢測水平的比較 （±s）

注：?與對照組比較，P ＜0.05

組別Pro-GRP /（pg/ml）CEA/（ng/ml）NSE/（ng/ml）CYFR21-1/（ng/ml）對照組（n =40）34.93±16.082.93±1.368.66±2.081.57±0.75 SCLC組（n =13）1 943.71±208.53?13.49±2.7680.83±10.57?17.79±4.36 NSCLC組（n =32）47.69±24.1165.05±19.5117.79±4.3624.68±6.47?F值31.3202.48015.6753.123 P值0.0010.0910.0010.049

表2 DC-CIK細胞治療前后Pro-GRP、T淋巴細胞亞群水平的比較 （±s）

表2 DC-CIK細胞治療前后Pro-GRP、T淋巴細胞亞群水平的比較 （±s）

組別CD3+ /%CD4+ /%CD8+ /%CD4+/ CD8+Treg/%Pro-GRP/（pg/ml）NSCLC組（n =32）治療前59.6±3.631.7±2.827.3±3.61.2±0.215.0±3.947.69±24.11治療后62.3±3.835.8±2.623.8±1.91.5±0.111.7±4.037.13±15.23 t值10.43112.516-3.1097.120-6.132-3.915 P值0.0010.0010.0040.0010.0010.032 SCLC組（n =13）治療前49.4±12.125.8±5.923.8±6.21.1±0.19.0±1.21 943.71±208.53治療后59.2±9.930.9±5.428.4±4.91.2±0.17.6±1.1430.23±67.14 t值4.6995.1983.9511.213-8.153-3.911 P值0.0010.0010.0020.0410.0010.001

圖1 SCLC組治療前后T淋巴細胞亞群比較

圖2 NSCLC組治療前后T淋巴細胞亞群比較

圖3 NSCLC組治療前后T淋巴細胞比

圖4 SCLC組治療前后T淋巴細胞比

圖5 兩組治療前后Pro-GR水平比較

表3 DC-CIK生物治療前后Pro-GRP與T淋巴細胞亞群相關系數

3 討論

肺癌是一種原發于肺、氣管及支氣管的惡性腫瘤。惡性腫瘤患者普遍存在免疫功能低下，免疫細胞不能有效識別、排斥和殺滅腫瘤細胞，T淋巴細胞及亞群是機體關鍵性免疫活性細胞，在免疫監視、殺傷靶細胞及免疫調節方面具有極重要的作用[3]。當肺癌患者T淋巴細胞及其亞群數量發生變化或CD4+/CD8+細胞比值異常時，可視為免疫調節功能紊亂。

CD3+細胞反映機體總的細胞免疫狀態，一般為CD4+與CD8+細胞數之和。肺癌患者免疫功能紊亂或低下，細胞免疫功能處于抑制狀態，CD3+細胞減低。本研究顯示，DC-CIK細胞回輸生物治療后，患者體內的淋巴細胞亞群發生明顯變化，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+較治療前上升，DC-CIK生物治療增加IFN-g、IL-2細胞因子的分泌，促進CD4+的分化和增殖，CD4+淋巴細胞輔助誘導其他淋巴因子抑制腫瘤細胞增生[4]，分泌IL-2、IFN-g、TNF-β等細胞因子殺傷腫瘤細胞，激活巨噬細胞、自然殺傷細胞抑制腫瘤基因表達，以達到抑制腫瘤病毒的繁殖，使腫瘤細胞生長停滯，誘導腫瘤細胞凋亡[5]來調節機體其他免疫細胞的功能。本實驗結果顯示，NSCLC組SCLC組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+治療前后的比較，表達增高證明DC-CIK免疫治療調節患者的免疫功能，提高患者的抗腫瘤免疫水平，恢復肺癌患者的免疫監視功能。

抑制T細胞CD8+通過分泌IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等細胞因子，直接對抗原呈遞細胞產生細胞毒效應，通過獨特型網絡抑制B細胞產生抗體[6]，本實驗顯示，NSCLC組CD8+細胞在生物治療前后的比較結果下降，證明DC-CIK細胞抑制CD8+細胞的負向調節，CD8+細胞數量減少有利于抑制腫瘤持續增長[7]，但是在SCLC組CD8+在生物治療后上升，兩組比較有差異，可能原因CD8+細胞根據是否表達CD28分為毒性T細胞和抑制T細胞，前者具有細胞毒性功能，后者具有免疫抑制功能[8]，這使得CD8+細胞具有雙相調節功能，兩者的相互作用在NSCLC和SCLC表達有差異，并且SCLC腫瘤惡性程度較高，廣泛浸潤導致免疫監視功能停滯，T淋巴細胞已基本喪失免疫功能，無法快速恢復至正常水平，導致兩者在CD8+細胞表達有差異，具體原因還需要進一步的研究。

當腫瘤發生免疫逃避時，Treg細胞通過分泌IL-6和IL-17細胞因子，誘導STAT3轉錄因子的活化，從而抑制CD4+和CD8+細胞及DC細胞的活化和增殖，DC-CIK生物治療前后NSCLC組與SCLC組Treg細胞較治療前下降，說明DC-CIK生物治療降低Treg細胞表達、逆轉Treg細胞對腫瘤患者的免疫抑制作用，從而增強患者免疫識別和殺傷功能。

本研究采用電化學發光方法檢測Pro-GRP，實驗顯示Pro-GRP和NSE在SCLC組高于NSCLC組，早期的實驗報道證明Pro-GRP在SCLC組中具有高表達[9]，Pro-GRP對SCLC診斷的特異性和敏感性高于NSE[10-11]。本實驗也證明Pro-GRP可以作為一種特異的SCLC腫瘤標志物，在患者未經治療前顯示出較高的水平，治療后呈現下降趨勢，在SCLC組降低更加明顯。SCLC組Pro-GRP治療前與T淋巴細胞亞群呈負相關，與Treg細胞呈正相關，即Pro-GRP越高T淋巴細胞亞群數值越低，說明SCLC患者的Pro-GRP越高其免疫調節功能越差，免疫抑制越強，而在NSCLC組并無相關性，研究證明Pro-GRP可以作為SCLC患者免疫功能的臨床評價指標，在治療過程Pro-GRP的下降可以提示患者免疫功能變化，還需要擴大標本量，進行更深一步的研究。

綜上所述，DC-CIK生物治療增強患者特異性殺傷腫瘤的能力，提高機體的免疫監視功能，抑制腫瘤免疫逃逸，改善患者的免疫功能。DC-CIK生物治療提高傳統化療肺癌患者的療效，增強抗腫瘤效果[12-15]。然而，DC-CIK療法是目前不用于肺癌常規治療，主要因為細胞療法需要個體化成本較高，因此，降低DCCIK療法的成本使其將來可提供給更多的患者。