肝細(xì)胞癌患者血漿SPINK1水平及其與患者預(yù)后的關(guān)系分析

王偉，王惠芳，翟景明，封冰

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）為原發(fā)性肝癌分類(lèi)中最常見(jiàn)的組織類(lèi)型，約占70%～85%。因HCC起病隱匿，早期癥狀不明顯，導(dǎo)致大多數(shù)患者在就診時(shí)已處于疾病晚期[1，2]。血清甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）為原發(fā)性肝癌患者典型的血清腫瘤標(biāo)志物，但其用于HCC診斷仍有一定的局限性[3]。絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal 1型（serine peptidase inhibitor Kazal type 1,SPINK1）又稱(chēng)分泌性胰蛋白酶抑制劑（PSTI）或腫瘤相關(guān)胰蛋白酶抑制劑（TATI），位于第5號(hào)染色體上，具有類(lèi)似表皮生長(zhǎng)因子作用，可通過(guò)表皮生長(zhǎng)因子受體通路而使腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲。近年來(lái)，有研究顯示SPINK1在結(jié)直腸癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌中均有表達(dá)[4-6]。有研究顯示SPINK1水平高低可反映肝硬化進(jìn)展為肝癌的風(fēng)險(xiǎn)大小[7]。本文檢測(cè)了HCC患者血清SPINK1水平，并分析了其與患者預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2014年5月～2015年9月我院收治的HCC患者80例（男48例，女32例；年齡43～66歲，平均年齡54.42±5.61歲；肝功能Child-Pugh A級(jí)58例，B級(jí)22例）；乙型肝炎肝硬化患者40例（男24例，女16例；年齡45～65歲，平均年齡51.44±5.34歲；肝功能Child-Pugh A級(jí)29例，B級(jí)11例）。分別符合《原發(fā)性肝癌規(guī)范化診斷指南(2015年版)》[8]和慢性乙型肝炎防治指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)；另選正常人30例（18例，女12例；年齡40～55歲，平均年齡50.40±5.65歲）。本研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核同意，納入對(duì)象簽署知情同意書(shū)。

1.2 治療方法 所有HCC患者均接受肝癌根治術(shù)，術(shù)前未進(jìn)行TACE或放射治療。

1.3 血漿SPINK1和AFP水平檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)血漿SPINK1水平（臺(tái)灣ABNOVA公司），血漿SPINK水平參考范圍為0～2 μg/L；采用ELISA法檢測(cè)血漿AFP（美國(guó)NOVATEINBIO公司），參考范圍為 0～20 μg/L。

1.4 預(yù)后判斷 術(shù)后隨訪2年，隨訪內(nèi)容包括一般情況、術(shù)后生存時(shí)間、肝臟功能、AFP、B超及胸部X線片，以ROC曲線下SPINK1的最佳診斷截?cái)帱c(diǎn)將患者分為血清SPINK1高水平組和SPINK1低水平組，分析SPINK1與預(yù)后的關(guān)系。預(yù)后指標(biāo)包括總生存時(shí)間（OS）、無(wú)瘤生存時(shí)間（DFS）和復(fù)發(fā)率。OS指自隨機(jī)化分組開(kāi)始，至因任何原因引起死亡的時(shí)間；DFS指根治術(shù)后體內(nèi)無(wú)腫瘤病灶，直至腫瘤復(fù)發(fā)的時(shí)間；復(fù)發(fā)：依據(jù)實(shí)驗(yàn)室化驗(yàn)和影像學(xué)檢查結(jié)果，綜合判定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)，復(fù)發(fā)率等計(jì)數(shù)資料以%表示，采用x2檢驗(yàn)，血漿SPINK1和AFP水平等計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)；以1-特異度為橫坐標(biāo)，以靈敏度為縱坐標(biāo)繪制ROC曲線，評(píng)價(jià)血漿SPINK1和AFP水平診斷HCC的效能，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組人群血漿SPINK1和AFP水平比較 HCC患者SPINK1水平顯著高于肝硬化患者或正常人（t=7.62、t=19.63，P＜0.05）；肝硬化患者血漿 SPINK1水平顯著高于正常人（t=17.57，P＜0.05）；HCC患者血漿AFP水平顯著高于肝硬化患者或正常人（t=38.40、t=34.108，P＜0.05），肝硬化患者AFP水平與正常人比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

表1 三組人群血漿SPINK1和AFP水平（±s）比較

表1 三組人群血漿SPINK1和AFP水平（±s）比較

與正常人比，①P＜0.05；與肝硬化比，②P＜0.05

例數(shù) SPINK1（μg/L） AFP（μg/L）HCC 80 2.4±0.3①② 125.7±14.5①②肝硬化 40 2.0±0.2① 35.4±4.2正常人 30 1.3±0.1 3.6±0.5

2.2 血漿SPINK1和AFP診斷HCC的效能情況經(jīng)ROC曲線分析，發(fā)現(xiàn)術(shù)前血漿SPINK1診斷HCC的曲線下面積為0.768，95%置信區(qū)間為0.702～0.837，最佳截?cái)帱c(diǎn)為 1.70 μg/L，即當(dāng) SPINK1=1.70 μg/L時(shí)，其診斷HCC的靈敏度和特異度分別為77.2%和67.6%；ROC曲線分析顯示術(shù)前血漿AFP診斷HCC的曲線下面積為0.735，95%置信區(qū)間為0.649～0.824，最佳截?cái)帱c(diǎn)為 124.8 μg/L，其診斷HCC的靈敏度為63.4%，特異度為62.5%（圖1）。

圖1 血漿SPINK1和AFP診斷HCC的ROC曲線分析

2.3 術(shù)前不同血清SPINK1水平的HCC患者生存情況比較 以上述SPINK1最佳診斷截?cái)帱c(diǎn)1.70μg/L為界，將患者分為SPINK1高水平組（術(shù)前SPINK1＞1.7 0μg/L）和SPINK1低水平組（術(shù)前SPINK1＜1.70μg/L）。與術(shù)前 SPINK1＜1.70μg/L患者比較，術(shù)前SPINK1＞1.7 0μg/L患者OS和DFS均明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）。

表2 術(shù)前不同血清SPINK1水平的HCC患者生存情況（±s）比較

表2 術(shù)前不同血清SPINK1水平的HCC患者生存情況（±s）比較

與術(shù)前 SPINK1＜1.7 μg/L 比，①P＜0.05

血清SPINK1 例數(shù) OS（m） DFS（m）＞1.7 μg/L 4 12.2±1.3① 11.2±1.2①＜1.7μg/L 38 20.5±2.1 15.7±1.9

2.4 兩組復(fù)發(fā)率比較 術(shù)前SPINK1＞1.7 0 μg/L患者術(shù)后復(fù)發(fā)率為38.1%（16/42），顯著高于術(shù)前SPINK1＜1.70 μg/L 患者的 18.4%（7/38，x2=5.18，P＜0.05）。

3 討論

我國(guó)HCC發(fā)病率較高，全球每年新發(fā)HCC患者中50%以上來(lái)自中國(guó)，HCC多由肝硬化發(fā)展所致，肝硬化可經(jīng)再生結(jié)節(jié)、低度不典型增生結(jié)節(jié)、高度不典型增生結(jié)節(jié)、增生結(jié)節(jié)癌變等“多步驟癌變”途徑轉(zhuǎn)變?yōu)镠CC。因此，早期對(duì)肝硬化患者進(jìn)行定期檢查，尋找有效的指標(biāo)準(zhǔn)確診斷HCC并采取合理治療措施有重要現(xiàn)實(shí)意義[9]。現(xiàn)階段血清腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)因具有特異性高、敏感性高、痛苦少、費(fèi)用相對(duì)較低等優(yōu)點(diǎn)而成為研究的熱點(diǎn)，其中經(jīng)典生物標(biāo)志物AFP診斷HCC的靈敏度、特異度不高。腫瘤的發(fā)生是一個(gè)漸進(jìn)的過(guò)程，其中抑癌基因失活為導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，絲氨酸蛋白酶抑制劑（serpins）為最新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因，serpins與絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族具有高度同源性[10，11]。SPINK1 作為 serpins家族一員，最早從牛的胰腺中分離出來(lái)，因此被稱(chēng)為PSTI，后在卵巢癌患者尿液中也被發(fā)現(xiàn)，因此又稱(chēng)為T(mén)ATI。SPINK1由位于人體第5號(hào)染色體的四個(gè)外顯子組成的基因編碼，SPINK1由56個(gè)氨基酸組成，經(jīng)3個(gè)二硫鍵連接，是激活胰蛋白酶原的第一道防線，主要功能為抑制胰蛋白酶活性，同時(shí)這種作用是可逆的。研究顯示SPINK1常以高水平出現(xiàn)在胰腺及胰液中，主要作用為可逆性阻止絲氨酸蛋白酶依賴的細(xì)胞凋亡。當(dāng)持續(xù)保溫時(shí)，胰蛋白酶會(huì)裂解SPINK1的肽鍵而導(dǎo)致SPINK1蛋白復(fù)合物迅速解離，如此循環(huán)，有利于防御胰蛋白酶過(guò)早激活[12-14]。Jobst J et al[15]采用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）檢測(cè)確定肝細(xì)胞癌與非肝細(xì)胞癌組織特異性基因表達(dá)譜及表達(dá)水平，結(jié)果顯示SPINK1/TATI在肝癌組織呈最穩(wěn)定的表達(dá)，陽(yáng)性率為90%，因此認(rèn)為SPINK1/TATI可作為丙型肝炎病毒引起肝癌的腫瘤標(biāo)志物，有助于早期地診斷肝癌。Marshall A et al[16]的研究結(jié)果顯示遺傳性血色病并發(fā)肝癌組織SPINK1 mRNA呈高水平，在肝硬化結(jié)節(jié)、混合病因肝癌中其陽(yáng)性率分別為0%或79%，因此認(rèn)為SPINK1作為分泌型胰蛋白酶抑制劑，是診斷肝癌潛在的標(biāo)志物，但國(guó)內(nèi)關(guān)于SPINK1在HCC患者的臨床意義還少有報(bào)道。

有人[17]采用RT-PCR、免疫印跡法和ELISA法檢測(cè)了乙型肝炎病毒（HBV）感染對(duì)SPINK1的影響及其調(diào)節(jié)機(jī)制，他們發(fā)現(xiàn)SPINK1在慢性乙型肝炎患者血清中水平顯著升高，肝硬化和肝細(xì)胞癌患者血漿SPINK1水平顯著高于慢性乙型肝炎患者。本研究結(jié)果顯示HCC患者、肝炎肝硬化患者、正常人血漿SPINK1水平依次減少，且三組血漿SPINK1水平兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與上述報(bào)道結(jié)果基本一致，因而在HCC患者，血漿SPINK1水平升高，同時(shí)HCC患者血漿SPINK1水平顯著高于肝炎肝硬化患者，體現(xiàn)了SPINK1作為HCC標(biāo)志物的可能性。國(guó)外學(xué)者Hass HG et al[18]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在肝癌組織AFP陽(yáng)性率僅為30%，而64%～82%肝癌組織 OPN、SPINK1、GPC3、HSP90 和 knpa2 陽(yáng)性，因此認(rèn)為 OPN、SPINK1、GPC3、knpa2在肝癌組織有較高水平的表達(dá)，這些基因有助于未來(lái)發(fā)現(xiàn)肝癌生物標(biāo)記物并制定新的診斷肝癌策略。本研究結(jié)果顯示HCC患者血漿AFP較肝硬化患者和正常人高，肝炎肝硬化患者血清AFP水平高于正常人。ROC曲線分析結(jié)果顯示血漿SPINK1水平診斷HCC的靈敏度為77.2%，特異度為67.6%，而血漿AFP分別為63.4%和62.5%，與有關(guān)研究[19-22]結(jié)果相近，表明血漿AFP在肝硬化階段也有升高，血漿SPINK1水平在肝硬化階段也已開(kāi)始上升，當(dāng)發(fā)展至HCC時(shí)，其水平更高。因此，SPINK1診斷HCC的效能可能較AFP好，具有更高的靈敏度和特異度，有成為HCC標(biāo)志物的潛能。在SPINK1與預(yù)后關(guān)系方面，另有研究結(jié)果[23,24]顯示，在隨訪58.6 m期間，SPINK1高水平組中位生存時(shí)間為12.3 m，較SPINK1低水平組的29.2 m縮短，SPINK1高水平組術(shù)后無(wú)瘤生存時(shí)間也明顯短于SPINK1低水平組，而復(fù)發(fā)率高于SPINK1低水平組，進(jìn)一步分析結(jié)果顯示SPINK1高水平是肝癌術(shù)后總體生存和無(wú)瘤生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而本研究結(jié)果顯示SPINK1高水平組總生存時(shí)間和無(wú)瘤生存時(shí)間均較SPINK1低水平組短，前者術(shù)后2年內(nèi)復(fù)發(fā)率高于后者，與上述研究結(jié)果相近，因此HCC患者血漿SPINK1水平高低與其預(yù)后關(guān)系密切，術(shù)前檢測(cè)血漿SPINK1水平對(duì)于預(yù)測(cè)預(yù)后有重要的參考價(jià)值。

綜上所述，HCC患者血漿SPINK1水平顯著高于肝硬化患者，與AFP相比，有類(lèi)似的診斷HCC效能。但如何提高其診斷的靈敏性、特異性和正確率，將是未來(lái)研究的熱點(diǎn)。