膽管細胞癌組織S100A6 mRNA及其蛋白表達變化*

李福榮，牛福勇，李華

膽管細胞癌是指發生于肝內膽管的癌腫，屬原發性肝癌的一種[1]。膽管細胞癌的病因至今尚不清楚，已有報道指出膽道慢性炎癥和感染、膽管或膽囊結石的慢性刺激、潰瘍性結腸炎、先天性膽管囊腫、肝吸蟲感染、膽道手術史、原發性硬化性膽管炎、乙型肝炎病毒感染、膽管癌基因突變等因素與膽管癌發生密切相關[2-4]。近年來，膽管細胞癌的發病率及死亡率在全球范圍內有升高的趨勢。隨著影像學檢查手段和膽管細胞癌相關生物分子的檢測對膽管癌的早期診斷、轉移發現及預后判斷方面取得了重要的進展。S100鈣結合蛋白 A6（S100 calcium-binding protein A6，S100A6）是 S100 家族成員，主要通過與Ca2+以及靶向蛋白相互作用，參與細胞周期調節、基因轉錄、細胞增殖及分化等過程[5，6]。有研究報道指出，有效沉默S100A6基因可有效抑制食管癌細胞的增殖和遷移能力[7]，而在結腸癌，S100A6的表達對腫瘤的發生發展起著重要的促進作用[8]。本研究檢測了膽管細胞癌組織S100A6 mRNA水平及其蛋白表達的變化，并分析了其與實驗室檢測指標和臨床病理學參數的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2008年1月～2014年12月在我院接受手術切除、術后經病理學檢查證實的膽管細胞癌患者40例，男26例，女14例；年齡39～79歲，平均年齡（59.68±14.53）歲。根據國際抗癌聯盟（Union for International Cancer Control，UICC）標準對膽管細胞癌組織進行TNM分期，根據Lauren's分型標準進行組織病理學分型。TNM分期：I期12例，II期16例，III期12例；腫瘤分化：高分化7例，中分化19例，低分化14例。排除伴有心、肺、腎等重要臟器嚴重疾病患者。選擇同期在本院就診的膽道良性疾病患者40例作為對照，男22例，女18例；年齡37～80歲，平均年齡（58.77±14.68）歲。包括膽囊結石18例，膽囊息肉12例，急性胰腺炎2例，慢性膽囊炎8例。本研究獲得我院醫學倫理學委員會批準，由直系親屬簽署知情同意書。隨訪截止日期為2015年12月31日。

1.2 組織S100A6 mRNA及其蛋白檢測 自-80℃低溫冰箱中取出待檢的膽管細胞癌組織、癌旁組織、肝組織25～40 mg，按照RNA提取試劑盒（Omega公司）說明書要求提取總RNA，并以此為底物進行Real-time PCR。引物，S100A6 F:5'-CTCACCATTGGCTCGAAGCT-3'，R:5'-GTTCACCTCCTGGTCCTTGTTC-3'；GAPDH F:5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，R:5'-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3'。擴增條件為:95℃ 3 min，94℃ 30 s，55℃ 退火30 s，72℃30 s，30個循環。以△Ct(目的基因)-△Ct（內參基因）計算實驗組和對照組的△Ct，按照△△Ct=△Ct（實驗組）-△Ct（對照組）計算mRNA相對水平的差值，即2-△△Ct。提取各組織蛋白，測定蛋白濃度。常規行Western blot（一抗、二抗購自Sigma公司），主要包括蛋白質樣品獲得、考馬斯亮藍G-250染色法測定蛋白、SDS-PAGE、電轉移、免疫反應等過程。以目的蛋白與內參照蛋白GAPDH的積分吸光度比值表示蛋白相對表達量。

1.3 血清S100A6水平、血常規、血生化和腫瘤指標檢測 采用ELISA法檢測血清S100A6（美國R&D systems公司）；使用深圳雷杜公司RT7200全自動血液分析儀和日本奧林巴斯公司AU2700型全自動生化分析儀檢測血常規、生化指標和CA125、癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）、C反應蛋白（CRP）。

1.4 統計學分析 應用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析。計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，計數資料采用x2檢驗。采用Spearman秩相關分析。采用非條件Logistic回歸單因素或多因素分析。多分類變量以啞變量形式進入回歸模型，變量入選標準為α≤0.05，剔除標準為α＞0.05。P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異非常顯著。

2 結果

2.1 不同組織S100A6 mRNA及其蛋白表達情況 在40例癌旁組織和肝組織中，S100A6蛋白分別陽性8例（20%）和12例（30%），顯著低于肝內膽管癌組織的 26例（65%，P＜0.05）；癌旁組織和肝組織 S100A6 mRNA相對水平顯著低于肝內膽管癌組織（P＜0.05）；癌旁組織和肝組織S100A6蛋白相對表達量顯著低于肝內膽管癌組織（P＜0.05，表1）。

表1 不同組織S100A6 mRNA及其蛋白水平（±s）比較

表1 不同組織S100A6 mRNA及其蛋白水平（±s）比較

例數 mRNA水平 蛋白表達量癌旁組織 40 0.92±0.33 0.56±0.16肝組織 40 1.12±0.46 0.85±0.46癌組織 40 1.93±0.57 1.63±0.51

2.2 膽管細胞癌患者血清S100A6水平及其與實驗室檢測指標的相關性 40例膽管細胞癌患者血清S100A6水平為（2456.85±128.31）pg/ml，顯著高于對照組的（2234.26±116.35）pg/ml（P＜0.05）；血清S100A6與CEA或CRP呈正相關（P＜0.05），與其它指標無相關性（P＞0.05，表 2）。

表2 膽管細胞癌患者血清S100A6與實驗室檢測指標的相關性分析

2.3 膽管細胞癌患者血清S100A6水平與臨床病理學參數的相關性 膽管細胞癌患者血清S100A6水平與性別、年齡無相關性（P＞0.05），與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期、腫瘤分化程度呈正相關（P＜0.05，表 3）。

表3 膽管細胞癌患者血清S100A6水平與臨床病理學參數的相關性

2.4 影響膽管細胞癌患者血清S100A6高水平的多因素Logistic回歸分析 多因素Logistic回歸分析結果顯示，腫瘤浸潤深、淋巴結轉移、TNM分期和腫瘤細胞分化差是膽管細胞癌患者血清S100A6高水平的危險性因素（P＜0.05，表 4）。

表4 影響膽管細胞癌患者血清S100A6高水平的多因素Logistic回歸分析

3 討論

S100A6又稱為鈣周期蛋白，是S100蛋白家族中核心成員之一。該蛋白具有兩個EF手型結構(螺旋-環-螺旋鈣結合域)，其羧基端與鈣離子具有較高的親和性。當與鈣離子結合后，EF手型經典區暴露，進而與相應的靶蛋白作用，發揮其生物學效應。它在腫瘤中的異常表達可通過各種基因調控及信號通路途徑對胃癌、胰腺癌、肝癌、膽管癌、結腸癌等腫瘤的生長、增殖、入侵和轉移起重要作用。該蛋白有可能成為臨床上新的腫瘤診斷分子標志物[9-11]。

目前，國內外關于S100A6與膽管細胞癌相互作用以及對膽管細胞癌患者術后預后影響的研究相對較少。Kim et al研究團隊通過微分斑點雜交和Northern blot分析發現，S100A6在肝內腫瘤組織表達上調。相比于肝細胞癌，膽管細胞癌S100A6 mRNA水平顯著增加，且免疫組織化學檢測發現77.8%膽管癌組織染色陽性，10%原發性肝癌陽性，研究結果提示S100A6或許可用來區分膽管細胞癌與肝細胞癌[12]。Sato團隊為研究S100A6蛋白在膽管癌組織表達的臨床和病理學意義，進行了較為深入的研究，結果發現膽管癌形成可誘導S100A6蛋白的表達，且S100A4、S100A6、S100P在細胞質和細胞核內的表達與臨床病理因素 (淋巴結轉移和臨床分期)無相關[13]。有研究用提取自魚藤芏的橙桑黃酮治療膽管癌并對癌細胞進行蛋白質組學分析，結果發現S100A6蛋白表達上調，提示S100A6可能對膽管細胞癌細胞具有抑制作用[14]。本研究結果顯示，癌旁組織、肝組織、膽管細胞癌組織S100A6蛋白陽性表達率分別為20%、30%、65%，三者間差異有統計學意義。膽管細胞癌組織S100A6 mRNA和蛋白相對表達量高于癌旁組織或肝組織，或許提示血清S100A6高水平有助于膽管細胞癌的診斷。膽管細胞癌患者血清S100A6水平顯著高于對照組。

除了膽管細胞癌，S100A6與胃癌、胰腺癌、肝癌、結腸癌等也密切相關。之前有報道指出，通過shRNA表達載體途徑可在食管癌Eca109細胞有效沉默S100A6基因，并進一步抑制該細胞的增殖活性及遷移能力[7]。也有研究表明，膀胱癌、汗腺腫瘤和子宮內膜異位癥患者血清S100A6呈高水平。Duan研究團隊發現，在結直腸癌，S100A6可通過影響MAPK通路促進癌細胞的增殖、分化和轉移[8]。在肝細胞癌中也存在著S100A6基因的過度表達，并且推斷其通過PI3K/Akt信號通路及與β-鈣黏素有關的機制對肝癌發生發展起重要作用[15]。本研究發現，膽管癌患者血清S100A6水平與與CEA、CRP、浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期、腫瘤分化程度呈正相關，多因素Logistic回歸分析結果顯示，浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期、分化程度是腫瘤患者血清S100A6高水平的危險因素。基于上述研究和先前的文獻報道，我們推斷S100A6或許可通過β-catenin蛋白、PI3K/Akt信號通路或MAPK信號通路上調，增強了腫瘤細胞的侵犯性表型和惡性行為，并嚴重影響膽管癌患者術后的預后。本研究與馬亮等人的研究結論類似，他們證實S100A6蛋白表達與胃癌的腫瘤大小、浸潤深度、淋巴管和靜脈侵犯、淋巴結轉移、腫瘤TNM分期等呈正相關，高中度S100A6基因表達的患者累積生存率明顯低于不表達的患者，并指出腫瘤的浸潤深度、淋巴管及靜脈浸潤、淋巴結轉移、TNM分期以及S100A6高表達均為胃癌患者預后的獨立危險因素[16]。有研究指出，S100A6與膽管癌患者各實驗室指標無相關性，但與臨床病理學參數有較高的相關性，同樣指出血清S100A6水平高不利于膽管癌患者術后生存[17]。

本研究發現膽管癌患者肝組織和血清S100A6水平高，其意義還有待于進一步研究。