非酒精性脂肪性肝病小鼠肝組織脯氨酰內肽酶蛋白及其活性變化*

李夢婷，李兵航，周達，丁永年，陳源文，范建高

脯氨酰內肽酶（prolyl endopeptidase，PREP）與胰島素釋放、攝食行為、器官炎癥性疾病、炎癥因子代謝和肝再生等密切相關[1-5]。本團隊新近發現脂肪變肝細胞PREP活性升高，抑制PREP活性可部分阻斷肝細胞脂肪變[6]。本研究采用高脂飲食建立小鼠NAFLD模型，動態觀察了肝組織PREP蛋白及其活性變化，為PREP參與NAFLD發病的假說提供新的依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑 7～8周齡無特殊病原體雄性野生型C57BL/6J小鼠40只，體質量18～22 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司【生產許可證：SCXK（滬）2012-0002】；普通飼料熱量構成比為67%碳水化合物、10%脂肪和23%蛋白質，總熱卡為3.6 kcal/g；高脂飼料（10%豬油+2%膽固醇+88%基礎飼料）購自江蘇南通特洛菲飼料科技有限公司，其熱量構成比為52%碳水化合物、30%脂肪和18%蛋白質，總熱卡為4.8 kcal/g[7]；HE染色試劑盒購自湖北百奧斯生物科技有限公司上海分公司；Trizol和RT-qPCR試劑盒均購自日本Takara公司；兔抗小鼠PREP多克隆抗體購自Abcam公司；其他一抗和二抗均購自江蘇碧云天生物科技研究所；7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin，AMC）購自Sigma-Aldrich公司，Suc-Gly-Pro-AMC底物購自瑞士Bachem公司。

1.2 動物模型制備 用普通飼料適應性喂養1 w后，隨機將動物分為對照組和模型組，分別給予普通或高脂飼料喂養，分別在4 w和16 w，隔夜禁食，次日稱體質量，經眼眶靜脈取血，頸椎脫臼處死小鼠。留取血清和肝組織，在-80℃保存，部分肝臟經4%多聚甲醛固定，制備石蠟切片，常規HE染色，在光鏡下觀察。采用NAFLD活動度積分（NAFLD activity score，NAS）進行NAFLD活動度評分（0～8分），NAS＜3分排除 NASH，NAS≥5分則診斷 NASH，介于兩者之間者為NASH可能[8，9]。

1.3 血生化指標測定 采用全自動生化分析儀檢測。

1.4 肝組織PREP mRNA測定 稱量肝組織50 mg，應用Trizol法提取肝組織總RNA，采用RT-qPCR法將mRNA逆轉錄合成cDNA，經熒光定量PCR擴增，基因相對水平以 RQ 值（2-△△CT）表示，以 GAPDH 為內參，計算PREP基因相對水平。引物由上海生工公司設計合成，PCR擴增引物序列及產物長度：GAPDH（上游引物 5’-TGCACCACCAACTGCTTAG-3’， 下 游 引 物 5’-GGATGCAGGGATGATGTTC-3’，177bp）；PREP（上游引物 5’-GACCACTGATTACGGGTGCT-3’， 下 游 引 物 5’-AGAAGCATGGACGGGTACTG-3’，120 bp）。

1.5 肝組織PREP蛋白檢測 采用Western blot技術，取封閉后的膜加入兔抗小鼠PREP抗體（1:1000），4℃孵育過夜，加入HRP標記的二抗，采用增強化學發光法（Bio-Red，美國）顯色。應用Image Lab3.0軟件對目的條帶進行灰度值分析，以β-Actin為內參，對目的蛋白進行標準化。

1.6 肝組織PREP活性檢測 取肝組織約100 mg，均勻裂解在500 μl的Tris-HC（l10 mmol/L，pH7.4）中，4℃ 16000 g離心 20 min。取上清液 10 μl，加入到上述濃度Tris-HCl 465 μl中，在30℃水浴箱中孵育30 min。加入底物（4 mmol/L Suc-Gly-Pro-AMC）25 μl，在30℃水浴箱中反應60 min，加入1 mol/L醋酸鈉緩沖液（pH 4.2）500 μl終止反應。取終末反應體系100 μl置于96孔板，用BioTek Synergy H4測量熒光強度（激發波：360 nm，吸收波：460 nm）[10]。同時測定AMC標準曲線熒光強度，以標準曲線計算反應液中AMC的濃度。采用BCA法（碧云天）測定上清液蛋白濃度。測量結果以每毫克蛋白每分鐘能水解產生的AMC量（pmol/min/mg）來反映各樣本中PREP酶活性的高低。最終結果以模型組相對于對照組的倍數表示。

1.7 統計學處理 應用 SPSS 20.0（SPSS Inc.，Chicago，USA）統計軟件進行統計處理，計量資料以（±s）表示，兩樣本均數的比較采用獨立樣本的t檢驗，P＜0.05被認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組小鼠體質量、肝質量和睪脂指數比較 在造模4 w時，兩組小鼠體質量、睪脂指數（附睪脂肪質量/體質量）和肝指數（肝質量/體質量）均無顯著性差異（P＞0.01）；在造模16 w時，模型組小鼠體質量、睪脂指數和肝指數均顯著大于對照組（P＜0.01，表 1）。

表1 兩組小鼠體質量、睪脂指數和肝指數（±s）的比較

表1 兩組小鼠體質量、睪脂指數和肝指數（±s）的比較

與對照組比，①P＜0.05

只數 體質量（g） 睪脂指數（%） 肝指數（%）對照組 4 w 10 24.50±0.83 1.03±0.13 4.76±0.29 16 w 10 28.19±1.23 1.68±0.59 4.02±0.11模型組 4 w 10 24.01±0.93 1.25±0.42 4.78±0.23 16 w 10 32.93±2.72① 3.22±0.58① 4.64±0.46①

2.2 兩組小鼠血生化指標的變化 在高脂飲食16 w，模型組血生化指標顯著高于對照組（P＜0.05，表2）。

2.3 兩組肝組織病理學改變和NAS積分比較 對照組小鼠肝小葉結構完整，肝細胞內未見脂滴沉積（圖1A、圖1B）；高脂飼料喂養4 w后，小鼠肝組織出現輕度（5%左右）脂肪變性，部分有脂滴沉積，小葉內可見個別炎性細胞浸潤，偶見輕度氣球樣變性，但肝小葉形態和匯管區無結構性改變（圖1C），NAS積分升高；在高脂飲食喂養16 w時，模型組小鼠肝細胞廣泛（80%左右）大泡性脂肪變性，氣球樣變性易見，伴明顯炎性細胞浸潤，同時可見門脈區炎癥和壞死灶（圖1D、表3）。

2.4 兩組肝組織PREP mRNA及其蛋白表達和活性水平比較 在高脂飲食4 w末，模型組PREP mRNA、蛋白、活性水平與對照組相比均無統計學差異（P＞0.05）；在高脂飲食16 w末，模型組PREP mRNA和活性水平顯著升高，分別為對照組的（1.81±0.34）倍（P＜0.01）和（1.36±1.78）倍（P＜0.05），但蛋白表達量與對照組相比無統計學差異（P＞0.05，圖 2）。

表2 兩組血生化指標（±s）比較

表2 兩組血生化指標（±s）比較

與對照組比，①P＜0.05

只數 ALT(IU/L) AST(IU/L) TG(mmol/L) TC(mmol/L) FBG(mmol/L)對照組 4 w 10 49.90±9.54 124.14±32.45 0.51±0.03 3.17±0.57 8.02±1.27 16 w 10 28.60±4.01 97.60±13.07 0.99±0.15 2.94±0.18 4.26±0.65模型組 4 w 10 50.60±1.67 136.44±20.42 0.57±0.06 3.26±0.23 8.36±0.87 16 w 10 53.64±22.01① 119.46±15.90① 1.18±0.17① 4.34±0.44① 5.67±0.87①

圖2 小鼠肝組織PREP表達及活性

3 討論

本研究發現，小鼠肝組織PREP活性在高脂飲食誘導的NAFLD發病過程中存在動態變化。在單純性脂肪肝（高脂喂養4 w）時，模型組PREP活性與對照組相比無統計學差異，但當進展到NASH階段（16 w）時，模型組PREP活性較對照組顯著升高，結果提示PREP可能在NAFLD從單純性脂肪肝向脂肪性肝炎轉變中起一定作用。

本團隊在先前的研究中認識到PREP在肝內功能多樣[11-13]。在體外細胞學實驗研究中發現，脂肪變的肝細胞PREP mRNA和蛋白表達水平增加，抑制PREP活性能顯著改善游離脂肪酸誘導的肝細胞脂肪變[6]，但PREP在NAFLD體內的變化目前尚未見報道。與以往細胞學實驗研究結果不同的是，本研究發現在小鼠NAFLD模型，早期肝脂肪變并未導致肝內PREP mRNA、蛋白水平或活性的明顯增加，推測其原因可能與脂肪變細胞數量少、肝細胞釋放PREP入血和體內多器官均存在較高生理水平的PREP等因素有關[14]。檢測血清PREP水平變化及分離提取肝細胞測定PREP mRNA或蛋白水平有助于回答以上問題。造模16 w后進入NASH階段則出現廣泛肝細胞脂變，PREP mRNA表達增加和蛋白活性升高與體外實驗結果一致，但仍然沒有觀察到PREP蛋白水平的升高，原因需要在后續研究中進一步明確。

表3 兩組小鼠肝臟NAS積分（±s）比較

表3 兩組小鼠肝臟NAS積分（±s）比較

與對照組比，①P＜0.05

脂肪變性（0～3分） 小葉炎癥（0～3分） 氣球樣變（0～2分） NAS NAS≥5（只）對照組 4 w 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0 16 w 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0模型組 4 w 1.00±0.00① 1.00±0.58① 1.43±0.53① 3.43±0.79① 0 16 w 1.50±0.85① 2.10±0.74① 2.00±0.00① 5.60±1.43① 8

其實，PREP活性受到多方面的調控。在肝臟中，PREP較均衡的分布于肝細胞和庫普弗細胞[4]。PREP在肝臟的含量雖然遠不及腦、腎、睪丸等，但其活性卻是最高的[14]，這種酶蛋白量和活性不一致的現象提示生物體內存在內源性調節PREP活性的重要機制。這一機制與高脂喂養4 w和16 w所見肝內蛋白水平與活性水平不一致的體內結果可能有關。

PREP活性升高可能參與NASH的發生與發展，特別是炎癥的進展。有研究發現，膠原蛋白Ⅰ/Ⅱ先后依次經過基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）-8/9 和 PREP 的水解作用，可產生一種三肽脯氨酰-甘氨酰-脯氨酸（proline-glycine-prolin，PGP）[15]，PGP 能夠通過作用于中性粒細胞表面特異性趨化因子受體CXCR1/CXCR2對中性粒細胞產生趨化效應[15,16]，而中性粒細胞對NASH肝內炎癥微環境的產生起到關鍵作用[17]。然而，另一方面，本團隊早期研究發現，由PREP參與水解產生的N-乙酰基-絲氨酰-天門冬酰-賴氨酰-脯氨酸（AcSDKP）能夠抑制HSC激活和單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）分泌，有一定的抗炎抗纖維化作用[10,18]。因此，PREP的“雙重”作用在NAFLD/NASH疾病進展中如何失平衡，導致PREP功能向促炎、促纖維化方向偏移，最終導致NASH持續進展，是值得將來進一步探討的問題。