復(fù)方鱉甲軟肝片對(duì)二乙基亞硝胺所致原發(fā)性肝癌大鼠肝組織PCNA和α-SMA表達(dá)的影響*

高翔，尚雙艷

肝癌是臨床最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，死亡率高居我國(guó)所有惡性腫瘤的第二位[1-3]。近年來(lái)，中醫(yī)藥被大量用于防治多種類型的惡性腫瘤，并取得了較大的成就[4-5]，但如何尋找有效的抗肝癌中藥是臨床亟需解決的重要課題[6]。復(fù)方鱉甲軟肝片具有化瘀解毒，益氣養(yǎng)血之功效，臨床常用于治療肝硬化[7]。本研究觀察了復(fù)方鱉甲軟肝片對(duì)二乙基亞硝胺所致原發(fā)性肝癌大鼠肝組織增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）和平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）表達(dá)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、儀器、藥物與試劑 40只清潔級(jí)雌性SD大鼠，體質(zhì)量 151～172 g，平均體質(zhì)量（159.4±13.4）g，購(gòu)自西北農(nóng)林科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（陜）2016-1128。AS-SA1型全自動(dòng)血液分析儀（美國(guó)博大精密器械公司），EP-02型超高速離心機(jī)（德國(guó)昂奮實(shí)驗(yàn)儀器公司），Olympus 21型顯微照相系統(tǒng)（日本奧林匹斯公司）。羧甲基纖維素鈉（陜西安義生物制品有限公司），二乙基亞硝胺（DEN，中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院，于使用前配制成濃度為100 mg/L的DEN溶液，避光存放，每12 h更換）。復(fù)方鱉甲軟肝片（內(nèi)蒙古福瑞醫(yī)療科技股份有限公司），兔抗PCNA和抗α-SMA抗體（南京建成生物制品研究所）。

1.2 原發(fā)性肝癌大鼠模型的制備[9]將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、小劑量和大劑量復(fù)方鱉甲軟肝片處理組。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[8]，確定動(dòng)物給藥劑量，即大鼠劑量（mg.kg-1）=成人劑量（mg.kg-1）×6.25，其中成人體質(zhì)量以60 kg計(jì)，復(fù)方鱉甲軟肝片的一般人體劑量為6.0 g/60 kg=0.1 g.kg-1，折合每只大鼠為0.1×6.25=0.625g.kg-1，故本研究小劑量組給藥劑量為0.625 g.kg-1，大劑量組給藥劑量為1.25 g.kg-1。對(duì)除對(duì)照組外的其它各組大鼠進(jìn)行造模處理：給予大鼠50%四氯化碳大豆油溶液3 mL.kg-1，后肢皮下注射，2次/w，注射4 w后休息2 w，于第6 w開(kāi)始，將大鼠飲用水更換為95 μg.mL-1的DEN水溶液，每日更換1次，連用20 w；在對(duì)照組大鼠，則皮下注射等量空白大豆油，并給予普通飲用水。在小劑量組和大劑量復(fù)方鱉甲軟肝片處理組，大鼠在開(kāi)始飲用DEN溶液時(shí)，即開(kāi)始給予相應(yīng)劑量的復(fù)方鱉甲軟肝片（經(jīng)生理鹽水溶解，配制成密度為1.30 g/mL的液體）灌胃，1次/d，連續(xù)給藥20 w，在對(duì)照組和模型組則給予等量生理鹽水灌胃。在末次給藥后24 h，應(yīng)用乙醚麻醉動(dòng)物，采用腹主動(dòng)脈取血法取血4 mL，于低溫下3000 r/m離心2 min，分離血清，保存于-80℃冰箱待檢測(cè)。采取放血法將各組大鼠處死，取肝臟，記錄各組大鼠肝臟癌變只數(shù)、表面癌結(jié)節(jié)數(shù)和肝臟質(zhì)量，計(jì)算各組肝臟指數(shù)（肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100%）及癌變率（癌變只數(shù)/總數(shù)×100%）。將肝組織平均分為3部分，保存于-80℃冰箱，其中1份在10%甲醛溶液中固定，依次進(jìn)行脫水、透明及浸蠟處理，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色后進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)觀察。

1.3 血清生化指標(biāo)檢測(cè) 常規(guī)檢測(cè)（武漢博士德生物科技有限公司）。

1.4 肝組織PCNA和α-SMA檢測(cè)[10]組織切片4 μm，常規(guī)脫蠟，采用SP法檢測(cè)，抗PCNA和抗α-SMA工作濃度分別為1∶200和1∶500。PCNA蛋白陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞核染色，而α-SMA蛋白陽(yáng)性則為胞質(zhì)呈黃色顆粒。應(yīng)用Image-proplus 6.0圖像分析軟件對(duì)上述陽(yáng)性染色細(xì)胞進(jìn)行半定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以(±s)表示，采用t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝臟一般情況的比較 模型組肝臟癌變率為100%，提示本研究中造模較為成功；與模型組大鼠比，對(duì)照組、大劑量和小劑量復(fù)方鱉甲軟肝片處理組大鼠肝臟質(zhì)量、肝臟癌變率、肝臟指數(shù)和肝表面癌結(jié)節(jié)數(shù)均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與對(duì)照組比，大劑量和小劑量復(fù)方鱉甲軟肝片處理組大鼠肝臟質(zhì)量、肝臟癌變率、肝臟指數(shù)和肝表面癌結(jié)節(jié)數(shù)均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05,表1）。

表1 各組肝臟一般資料(%，±s)比較

表1 各組肝臟一般資料(%，±s)比較

與模型組比，①P＜0.05；與對(duì)照組比，②P＜0.05

只數(shù) 肝臟質(zhì)量（g） 肝臟指數(shù) 肝臟癌變 表面癌結(jié)節(jié)（個(gè)）對(duì)照組 10 13.16±1.34① 1.82±0.24① 0（0.0）① 0.00±0.00①模型組 10 25.59±2.38② 4.95±0.58② 10（100）② 14.14±2.37②大劑量 10 17.34±1.78①② 3.10±0.72①② 1（10.0）①② 3.16±0.45①②小劑量 10 19.89±1.80①② 3.89±0.81①② 3（30.0）①② 7.38±1.01①②

表2 各組肝功能指標(biāo)(±s)比較

表2 各組肝功能指標(biāo)(±s)比較

與模型組比，①P＜0.05；與對(duì)照組比，②P＜0.05

只數(shù) TBIL(μmol/L) AST(IU/L) ALT(IU/L) ALB（g/L）對(duì)照組 10 23.12±1.92① 86.46±9.14① 21.34±2.40① 38.48 ± 2.72①模型組 10 72.41±8.48② 278.26±27.34② 141.38±16.02② 26.32± 2.02②大劑量 10 53.58±4.15①② 167.58±17.30①② 49.27±5.16①② 33.14 ± 2.31①②小劑量 10 61.04±5.13①② 201.45±23.45①② 91.34±11.45①② 30.48 ± 2.22①②

2.2 各組大鼠肝功能指標(biāo)比較 與模型組大鼠比，對(duì)照組、大劑量和小劑量復(fù)方鱉甲軟肝片處理組大鼠血清TBIL、AST和ALT均明顯降低，TP和ALB含量明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與對(duì)照組大鼠比，大劑量和小劑量復(fù)方鱉甲軟肝片處理組大鼠血清TBIL、AST和ALT均明顯增高，而TP和ALB則均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，表2）。

2.3 各組大鼠肝組織病理學(xué)變化情況的比較 對(duì)照組大鼠肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)正常，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠肝組織癌細(xì)胞呈不同程度的分化，排列成巢狀，且核仁突出；在10只小劑量復(fù)方鱉甲軟肝片處理組中，3只大鼠出現(xiàn)了肝組織癌變，癌變大鼠肝組織癌細(xì)胞核仁突出，呈現(xiàn)巢狀或梁狀排列，但明顯輕于模型組，未癌變的大鼠肝組織則存在較為嚴(yán)重的壞死性肝硬化，且肝細(xì)胞有嚴(yán)重水腫、變性、壞死；大劑量復(fù)方鱉甲軟肝片處理組中僅1只出現(xiàn)了肝組織癌變，癌變大鼠肝組織癌細(xì)胞核仁較突出，呈現(xiàn)梁狀排列，但明顯輕于模型組，未癌變的大鼠肝組織則出現(xiàn)不同程度的壞死性肝硬化，肝細(xì)胞水腫、變性、壞死，其程度明顯輕于小劑量復(fù)方鱉甲軟肝片處理組中未發(fā)生癌變的大鼠（圖1）。

圖1 各組大鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)（HE，400×）

2.4 各組大鼠肝組織PCNA和α-SMA表達(dá)情況 模型組大鼠肝組織PCNA和α-SMA均呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；大劑量和小劑量復(fù)方鱉甲軟肝片處理組大鼠肝組織PCNA和α-SMA陽(yáng)性表達(dá)程度均明顯弱于模型組；對(duì)照組大鼠肝組織則僅偶見(jiàn)兩種物質(zhì)的陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。半定量分析結(jié)果表明，對(duì)照組、大劑量和小劑量復(fù)方鱉甲軟肝片處理組大鼠肝組織PCNA和α-SMA相對(duì)表達(dá)量均明顯低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與對(duì)照組比，大劑量和小劑量復(fù)方鱉甲軟肝片處理組大鼠肝組織PCNA和α-SMA相對(duì)表達(dá)量均明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，圖 2、圖 3、表 3）。

圖2 各組大鼠肝組織PCNA表達(dá)情況（SP，400×）

圖3 各組大鼠肝組織α-SMA表達(dá)情況（SABC，400×）

表3 各組大鼠肝組織PCNA和α-SMA相對(duì)表達(dá)量(±s)比較

表3 各組大鼠肝組織PCNA和α-SMA相對(duì)表達(dá)量(±s)比較

與模型組比，①P＜0.05；與對(duì)照組比，②P＜0.05

只數(shù) PCNA表達(dá)量 α-SMA表達(dá)量對(duì)照組 10 1.00±0.00① 1.00±0.00①模型組 10 19.59±2.67② 25.12±3.19大劑量組 10 5.98±1.12①② 7.96±1.37①②小劑量組 10 9.23±1.34①② 12.34±2.88

3 討論

采用DEN建立大鼠原發(fā)性肝癌模型，操作較為簡(jiǎn)單且成功率高，同時(shí)動(dòng)物在造模期間死亡率較低，已被廣泛用于原發(fā)性肝癌的藥物研發(fā)研究[11，12]。大鼠在服用DEN的早期階段肝臟可出現(xiàn)肝細(xì)胞變性及壞死等中毒性反應(yīng)，而在誘癌的中期階段，可出現(xiàn)肝細(xì)胞再生及肝纖維化等現(xiàn)象，晚期階段則在肝細(xì)胞出現(xiàn)結(jié)節(jié)性增生及肝硬化等后動(dòng)態(tài)演變形成肝癌，上述變化與人類原發(fā)性肝癌發(fā)病過(guò)程基本相似，故其模擬程度較高[13，14]。本研究模型組大鼠全部出現(xiàn)肝癌，說(shuō)明本方法造模可靠性高。

復(fù)方鱉甲軟肝片主要由鱉甲、當(dāng)歸、冬蟲(chóng)夏草、黨參、板藍(lán)根、莪術(shù)、黃芪、赤芍、三七、紫河車和連翹等藥材組成，具有益氣養(yǎng)血、軟堅(jiān)散結(jié)及化瘀解毒等功效，常用于治療肝硬化、慢性乙型肝炎肝纖維化等肝臟疾病[15]。方中冬蟲(chóng)夏草、黨參、黃芪、當(dāng)歸等均具有較好的抗腫瘤活性，正是由于復(fù)方鱉甲軟肝片具有較好的抗癌物質(zhì)基礎(chǔ)，我們用其干預(yù)DEN所致原發(fā)性肝癌動(dòng)物，期望為該藥的新型應(yīng)用提供一定的依據(jù)[16]。PCNA是一種細(xì)胞增殖標(biāo)志物，可協(xié)調(diào)癌細(xì)胞DNA合成，是腫瘤細(xì)胞增殖所必需的一種蛋白，作為一種重要的腫瘤標(biāo)志物，其表達(dá)情況可有效反映腫瘤細(xì)胞的增殖水平，尤其在肝癌及鼻咽癌等組織分化較差的惡性腫瘤，該蛋白的表達(dá)水平較高[17，18]。α-SMA可促進(jìn)肝組織星狀細(xì)胞的活化，后者可參與介導(dǎo)免疫抑制活性，誘導(dǎo)大鼠肝癌細(xì)胞的增殖和腫瘤細(xì)胞的遷移，故該蛋白在原發(fā)性肝癌的發(fā)病進(jìn)程中扮演著極為重要的角色[19，20]。

本研究大劑量和小劑量藥物處理組大鼠肝臟質(zhì)量、肝臟癌變率、肝臟指數(shù)和表面癌結(jié)節(jié)數(shù)均明顯低于模型組，提示復(fù)方鱉甲軟肝片能夠有效緩解DEN誘導(dǎo)的肝損傷，改善其肝功能，降低腫瘤的發(fā)生率。此外，大劑量和小劑量處理組大鼠肝組織PCNA和α-SMA表達(dá)量均明顯低于模型組，提示復(fù)方鱉甲軟肝片可抑制肝癌細(xì)胞的增殖及肝星狀細(xì)胞的激活，從而減輕了DEN所致肝纖維化及肝硬化，在一定程度上延緩了大鼠肝臟的癌變進(jìn)程，上述結(jié)果可能是本研究發(fā)現(xiàn)的復(fù)方鱉甲軟肝片防治原發(fā)性肝癌的主要作用機(jī)制之一。然而，本研究應(yīng)用的大劑量和小劑量中藥未表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系，且對(duì)于藥物的具體作用機(jī)制探討還不深入。因此，有關(guān)復(fù)方鱉甲軟肝片影響原發(fā)性肝癌進(jìn)程的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其詳細(xì)作用機(jī)制還有待于更進(jìn)一步的研究。