胺碘酮增加α-SMA表達誘導肺A549細胞上皮-間質轉化機制研究

陳皓 黃時偉 朱寧 吳悠揚 鄒賀 姜文兵

胺碘酮是預防及治療惡性室性心律失常的有效藥物，但會產生嚴重的副作用。既往報道，在胺碘酮治療的患者中，肺毒性發生率從1%～10%不等，即使是在低劑量情況下［1］。當胺碘酮誘導的肺纖維化（AIPF）被明確診斷時，為避免呼吸衰竭，立即停用并盡快降低胺碘酮的血藥濃度及皮質醇激素的強化治療被報道是有效的［2］，但在AIPF早期未被確診的患者將死于不可逆轉的呼吸衰竭。因此，闡明該機制并防范AIPF的發生和發展至關重要。本文探討胺碘酮誘導肺泡基底上皮細胞（A549）上皮-間質轉化（EMT）的機制。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）化學制品：胺碘酮購自江萊生物科技有限公司（上海）。胎牛血清，胰蛋白酶和Dulbecco改良的Eargle培養基購自Life Technologies（Grand Island，NY，USA）。肺 A549 細胞購自 ATCC（Rockville，MD，USA）。兔抗α-SMA 抗體購自Abcam（Cambridge，MA，USA）。Alexa Fluor 488和594綴合的抗兔IgG抗 體 購 自 Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz，CA，USA）。（2）細胞培養物：人肺泡上皮腺癌細胞系A549購自中國科學院（上海）。將A549細胞在含有10%胎牛血清（FBS），抗生素（100IU / ml青霉素，100μg/ ml鏈霉素）的DMEM的25cm2培養瓶和6孔培養板中在37℃，5%CO2的培養箱。當細胞達到80%融合時，用PBS洗滌，然后用0.25%胰蛋白酶消化細胞，從培養瓶中收集細胞，離心棄上清液，最后懸浮于完全培養基中，接種于塑料培養皿中。對所有實驗，將細胞傳代培養到6孔板中并維持直至亞匯合（80%），并在添加胺碘酮前將細胞血清剝奪24h。

1.2 方法 （1）免疫細胞化學分析：將A549細胞在6孔培養板中培養。為檢測α-SMA，將細胞在PBS中沖洗，然后在室溫（RT）下在4%多聚甲醛（PFA）中固定15min，用PBS沖洗5min，重復3次。然后加入含有0.01%Tween-20的10%牛血清白蛋白（BSA）并溫育2h以合并在RT處的非特異性結合。將細胞與α-SMA（1：150稀釋）的一級抗體在4℃溫育過夜。第2天用PBS洗滌細胞。使用的二抗是Alexa Fluor 488或594-綴合的抗 - 兔IgG抗體（稀釋度1：200），在黑暗中溫育2h。最后，將細胞在PBS中沖洗，并用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）孵育核染色10min。用配備熒光的相差顯微鏡（Nikon，Japan）拍攝熒光圖像。（2）Northern印跡分析：根據制造商的說明，使用Trizol試劑從A549細胞中提取總RNA。通過在260nm處的紫外吸收的分光光度測量來量化RNA。且通過在1.5%瓊脂糖凝膠上可視化28S和18S條帶來證實RNA完整性。使用RT-PCR試劑盒通過逆轉錄使用RNA樣品合成cDNA。設計的引物和已發表論文的確定引物被用于RT-PCR。用于該分析的α-SMA引物的序列如下：正向：5'-TGGCTGATGGAGTACTTC-3'和 反 向：5'-GATAGAGAAGCCAGGATG-3'。GAPDH被用作內部控制。GAPDH引物的序列如下：正向：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'和 反 向：5'-AACGGTAGTGTCTTTGTGA-3'。對于RT-PCR反應，PCR混合物在20μl終體積的SYBR主混合物（Invitrogen） 中 含 有 cDNA（1μl） 和 引 物（2μl）。94℃反應15min，94℃反應45s；55℃反應48s，72℃反應48s，共30個循環。PCR產物在2.0%瓊脂糖凝膠上運行。所有RT-PCR產物均表達相對于內部對照的基因表達的百分比變化。

1.3 統計學分析 采用SPSS18.0統計軟件。計量資料以（x±s）表示，采用多因素方差分析，Tukey多重比較檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫細胞化學分析肺A549細胞中α-SMA的表達 相差顯微鏡觀察A549細胞形態為立方形鵝卵石。在A549中微弱觀察到α-SMA（間充質標記）（見圖1A）。應用胺碘酮50μM（見圖1B）、100μM、150μM處理A549 72 h，采用免疫細胞化學方法檢測α-SMA的表達。與對照組比較，細胞外觀轉變成纖維細胞樣，長而窄，紡錘形形態，提示α-SMA的高表達（見圖1C、D）。結果表明胺碘酮可以誘導A549細胞中的EMT樣表型。

圖1 胺碘酮誘導的A549細胞系中α-SMA表達的劑量依賴性（400×）。將A549細胞在0．1%FBS培養基中與胺碘酮50μM（圖B），100μM（圖C），150μM（圖D）培育72h。免疫細胞化學分析顯示，與對照組（圖A）相比，胺碘酮對A549細胞的α-SMA表達呈劑量依賴性增加。隨著胺碘酮劑量的增加，上皮鵝卵石形態逐漸轉變成纖維樣細胞樣形態。上皮細胞標志物EMT標記α-SMA（綠色：A-D）；細胞核用DAPI（藍色）染色

2.2 胺碘酮對A549細胞EMT標志物表達的劑量依賴性變化 前期研究，A549細胞表現出對150μM胺碘酮作用72h的EMT，通過顯著增加間充質標記物α-SMA的表達，從其上皮表型轉變成成纖維細胞樣形態。將A549細胞與50μM，100μM和150μM胺碘酮溫育72h。免疫細胞化學分析表明，上皮鵝卵石形態在一定劑量下逐漸轉變成纖維樣細胞樣形態。且A549細胞標記物間充質細胞標記物α-SMA增加（見圖 1）。

2.3 實時RT-PCR分析胺碘酮在A549細胞中表達EMT標志物 見表1、2。

表1 各組α-SMA mRNA不同時間點不同劑量間表達的比較（x±s）

表2 各組α-SMA不同時間點不同劑量間表達的比較（x±s）

3 討論

特發性肺纖維化是以成纖維細胞和肌成纖維細胞群和細胞外基質定位擴張為特征的致命性肺部疾病。肺纖維化與上皮依賴性成纖維細胞活化過程有關。其特征是成纖維細胞、肌成纖維細胞和細胞外基質（ECM）的積累，最終導致肺結構的瘢痕形成和破壞。成纖維細胞和肌成纖維細胞灶被認為是IPF發病的中心特征。IPF中成纖維細胞和肌成纖維細胞的來源仍不完全清楚。迄今為止，已經提出肌成纖維細胞通過至少三種可能來源積累：駐留的肺成纖維細胞或間充質前體的增殖；骨髓來源的纖維細胞或循環祖細胞轉化成成纖維細胞和上皮 - 間質轉化（EMT），其中肺泡上皮細胞（AEC）經歷向（肌）成纖維細胞的轉變［3］。也有文獻表明EMT是IPF中成纖維細胞和肌成纖維細胞的重要起源［4］。EMT是上皮細胞逐漸喪失其上皮功能和特征并轉化為獲得間充質細胞特征的間充質樣細胞的過程。在EMT過程中，上皮細胞失去頂端基底極性，基底膜附著和細胞 - 細胞連接，上皮表型逐漸獲得間充質標志物（α- SMA，波形蛋白，N-鈣粘蛋白）。經歷EMT的細胞導致成纖維細胞增殖并將成纖維細胞轉化成合成和沉積ECM成分的成肌纖維細胞。現在越來越多的研究表明（肌）成纖維細胞確實可以通過EMT從上皮細胞衍生出來，并可能導致肺纖維化的發生［5］。幾項研究報道，一些藥物可以誘導EMT引起肺纖維化，如甲氨喋呤（MTX），博來霉素（BLM）［6-7］。然而，目前還沒有關于肺泡上皮細胞是否在AIPF中經歷相同EMT的數據。

本研究結果表明，胺碘酮可以通過EMT（肺纖維化的一部分）誘導肺A549細胞的纖維化反應。作者觀察到胺碘酮治療的肺A549細胞通過EMT的形態學改變與特發性肺纖維化非常相似。從這些發現中得出結論，至少在一定程度上，EMT可能在胺碘酮誘導的肺纖維化進展中起關鍵作用。

在過去幾年中，越來越多的證據表明，IPF可能是由復發性肺泡上皮細胞（AECs）損傷引起的，初始損傷導致AECs的異常活化，并隨之導致形成成纖維細胞病灶，這被認為是纖維化的活性部位［8］。眾所周知，胺碘酮及其代謝物對不同類型的細胞具有直接和間接毒性［9］。AECs與肺纖維化有關胺碘酮細胞毒性的關系仍不清楚。作者觀察到胺碘酮可引起肺纖維化，并導致肺A549細胞減少和肌成纖維細胞增殖。本研究結果表明胺碘酮誘導上皮細胞的細胞毒性和纖維化中的成纖維細胞的增殖。因此，肺A549細胞比成纖維細胞更易受到細胞損傷。

Willis等在2005年鑒定IPF患者肺組織中常見表達的上皮標志物和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA），表明細胞在IPF肺中發生表型轉換并首次描述EMT參與人肺纖維化過程的可能性［10］。在2006年，Kim［11］報道AECs是體內成纖維細胞的祖細胞，而ECM是纖維形成過程中EMT的關鍵調節因子。Xi及其同事指出，美多環素可通過抑制EMT抑制纖維化，進一步支持EMT信號在肺纖維化中的作用［12］。因此，越來越多的證據表明肺成纖維細胞和肌成纖維細胞可能通過EMT從上皮細胞中獲得。為闡明胺碘酮是否能誘導肺泡上皮細胞的EMT。經胺碘酮刺激后，肺泡上皮細胞呈纖維狀，長而窄，呈梭形，細胞間低度接觸。作者觀察到胺碘酮可以通過免疫細胞化學分析增加α-SMA的表達，從而通過EMT誘導肺纖維化。進一步發現α-SMA在肺A549細胞中的表達增加具有劑量依賴性和時間依賴性。

總之，胺碘酮通過增加α-SMA表達誘導肺A549細胞上皮-間質轉化，可能是胺碘酮誘發肺纖維化的重要促纖維化因子。EMT可能是胺碘酮誘導肺纖維化的重要步驟。因此，本研究預計會產生新的藥物發現，用于預防藥物誘導的纖維化，并為尋找仍然未被證實的肺纖維化機制提供線索。