豬SLA-DRB基因第二外顯子多態性分析

奚衍洋，趙云蛟，錢愛東

(吉林農業大學動物科學與技術學院，吉林長春 130118)

主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，簡稱MHC)是一類細胞表面糖蛋白，它能夠在細胞內通過蛋白水解作用結合源自宿主和病原體蛋白質的小肽片段。之后，MHC分子會將這些抗原表位呈遞到細胞表面，在那里它們被T細胞識別，這可以幫助免疫系統識別和應對外來抗原[1-2]。MHC由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等3類分子組成，前2類分子對抗原肽起到遞呈作用，而第Ⅲ類分子與免疫反應相關[3]。

按照MHC基因國際命名原則，除了小鼠(H-2)、大鼠(RT1)和雞(B)，剩余動物MHC的命名即在白細胞抗原(LA)前加上本物種英文名稱的首字母或是前2個字母，例如人、馬、牛、綿羊、狗的MHC分別為HLA、ELA、BoLA、OLA、DLA，因此豬的MHC亦稱為SLA。MHC分子的發現及提出源于距今60多年前有關小鼠的免疫試驗[4]，之后Jean Dausset發現第一個能夠抗人類白細胞表達抗原的同種抗體，成為了人類HLA基因的研究開端[5-7]。豬SLA基因是由Vaiman等[8]首次提出其具有編碼抗體、調控免疫的作用，隨后由Lunney等[9]同Mallard等[10]經試驗論證了該結論，且證實了SLA分子對機體免疫應答反應及抗原呈遞等方面均起到較大作用。

SLA基因多態性對于免疫反應的研究是至關重要的[11]。SLAⅡ類基因能夠調控外來病原和疫苗的免疫應答反應[12]，即控制傳染病的反應及影響疫苗的特異性和有效性[13]。據證實SLAⅡ類基因的匹配度是實體器官同種異體移植和骨髓細胞移植成功與否的重要條件[14]。本研究通過直接測序法從DNA水平對SLAⅡ-DRB1座位第二外顯子的多態性進行了分析，且從多方面解析豬的SLAⅡ類分子基因特征，為抗豬病原體的相關免疫研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料采自吉林長春某豬場共計20頭成年長白豬血液。將采集的豬血置于抗凝管并混勻，低溫凍存以備試驗。

1.2 基因組的提取及PCR擴增

利用Axyprep血基因組提取試劑盒，從豬的血液樣本中提取基因組。大約1 μL基因組DNA模板，各0.2 μL豬P1和豬P2引物[15](豬P1：5′-GTGTCTGCAGTACGTGTCCA-3′，豬P2：5′-TAGGATCCCTCACAGCGCATTTCTT-3′)，10 μL PremixTaq(TaKaRaTaqTMVersion 2.0 plus dye)加ddH2O至20 μL反應體系。PCR擴增體系為：94 ℃預變性 5 min，94 ℃變性30 s，64.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸 45 s，40個循環；72 ℃ 7 min終止延伸，4 ℃保存。

1.3 目的基因的克隆測序

PCR結束后，取5 μL產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收純化。將純化后的產物與與T克隆載體相連[pMD18-T vector，寶生物工程(大連)有限公司]，4 ℃過夜連接，將重組質粒轉化入DH5α感受態細胞中進行擴增。每個個體選取8～16個陽性克隆，送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.4 數據分析

將測序得到的DNA序列利用Bioedit V7.0.1和Clustal_X進行編輯和對齊，切除完全相同的引物序列，把重復序列和假陽性序列剔除，從而確定等位基因類型及推導出等位基因型的氨基酸序列。將整理得到的DNA等位基因型用DNAsp 5.10.01分析其核苷酸多態性水平。登錄GenBank選取人、鼠相關物種的MHC基因序列與本試驗得到豬的等位基因序列用Mega 6.0進行建樹分析。

2 結果與分析

2.1 血液基因組DNA

由圖1可見，提取得到的電泳圖條帶清晰，無明顯拖帶，可用作后續擴增模板。

2.2 豬SLA Ⅱ-DRB第二外顯子的擴增

擴增結果如圖2所示：條帶清晰，特異性強，片段大小接近245 bp。

2.3 測序結果分析

采取豬的樣本量共計20個個體，每個個體測序分別送樣15個陽性克隆，共得到300條序列，經編輯整理合并重復序列后得到上下游引物完整的DNA序列共計133條(包含3條假基因序列)其中132條長度為245 bp，1條為246 bp。將所測得的序列在線Blast比對，圖3是其在NCBI中與其他豬SLAⅡ-DRB1基因第二外顯子的比對結果。經檢測得到的序列與某豬(序列號：FJ169434.1)SLAⅡ-DRB1基因第二外顯子高度相似，證明所得序列是本試驗需要的目的片段。

2.4 等位基因分析

參照慣例將得到的等位基因型命名為 SLA-DRB1*01 至SLA-DRB1*45。如表1所示豬20個個體(標號A1、A2、B3等)的DNA等位基因型共整理得到45種。其中，標號為SLA DRB1*08的等位基因分布范圍最廣，在19個個體中存在，其次為SLA DRB1*07，分布在16個個體中，還有大部分基因型是分布在單個個體中。在A1和A4個體檢測到等位基因型最多，為10種。

2.5 核苷酸和氨基酸多態性

本試驗分析的45條等位基因序列，每條核苷酸序列198個位點，分析得到核苷酸多態位點共有102個，核苷酸多樣性水平為0.107 12，序列間的平均遺傳距離為0.118。經翻譯得到相應的DNA等位基因氨基酸序列，經編輯整理后得到豬45條DNA等位基因序列的推導氨基酸序列(圖4)，每條序列均為66個氨基酸。

2.6 系統進化分析

在GenBank選取人(GenBank登錄號：NM_001243965.1)與小鼠(GenBank登錄號：NM_207105.3)MHC基因序列同本試驗得到的45條豬SLAⅡ-DRB1第二外顯子等位基因序列基于Kimura雙參數模型構建N-J(Neighbor-Joining)系統進化樹(圖5)。可見，豬SLA-DRB1基因同人HLA-DRB1的親緣關系要比同小鼠H2-Ab1更近一些。

3 討論

SLA基因能夠影響MHC介導的免疫反應[16]以及動物的生產性狀[17]。目前，關于豬能夠作為生物學研究的理想大型動物模型的相關理論依據越來越多[18-20]，并且豬對于人的異種器官移植是一個良好的潛在供體[21]。考慮到以上多種的發展可能，尋求一種快速、準確、方便的方法以評估SLA多態性是很有必要的。有關SLA等位基因的分型方法多種多樣，目前主要包括PCR-直接測序分型法(PCR-SBT)、PCR-序列特異性引物(PCR-SSP)、PCR-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)及微衛星標記(MS)等。人們已經使用這些方法從不同豬種和豬細胞系中鑒定了許多SLAⅠ類和Ⅱ等位基因和單倍型[22]。其中，PCR-SBT方法是將PCR擴增得到的特定產物直接或克隆后進行測序從而直觀地獲取堿基突變位置及突變類型，是當前用來定義SLA特異性和多樣性的最直接和準確的手段。

本研究采集同一種群的20頭成年長白豬，對其血液DNA的SLAⅡ-DRB1第二外顯子進行PCR克隆測序。在DNA測序結果中，存在1個特殊長度的序列(246 bp)，且得到的全部DNA序列共存在3條假基因序列。說明DNA序列在PCR過程中可能存在缺失、插入、突變、移碼等過度修飾[23]。經各種軟件編輯分析得到的DNA等位基因序列為45條，其中等位基因在個體分布范圍為1～19個不等，單個個體為1個基因型占66.7%，所占比例較高。這種情況的出現可能與樣本量有關，也可能是稀有等位基因的廣泛分布[24]。通過在線Blast與豬的SLAⅡ-DRB座位第二外顯子參考基因序列(GenBank登錄號：EU918422.1)進行對照，可知得到的氨基酸序列是SLAⅡ-DRB第二外顯子編碼區的第4～69位。在對遺傳多態性分析中，得到多態性位點及多態性水平值均體現了豬SLA-DRB第二外顯子具有高度多態性。同人與小鼠MHC基因建立的系統進化樹中，可以發現與小鼠基因相比，人的基因貌似同豬SLA-DRB基因親緣關系更近，但它們同豬均屬于不同分支，豬同其他物種MHC基因的親緣關系仍需進一步探究。

表1 豬20個個體的等位基因分布

注：·表示個體存在該等位基因。

目前，MHC分子在人類免疫調節、器官移植和自身免疫疾病中起到的作用已經受到廣泛關注。隨著實驗動物模型的不斷開發能夠推進有關MHC各個方面的生物學研究。有關豬MHC的研究顯示SLA分子對于部分免疫疾病具有一定的指導意義，比如豬腹瀉[25-26]、口蹄疫病毒[27]、皮膚惡性黑色素瘤[28]、豬繁殖與呼吸綜合征病毒[29]、豬偽狂犬病病毒等[30]。本研究旨在對豬的SLAⅡ-DRB1座位第二外顯子進行多態性分析，從多個方面闡述了該基因的高度多態性特征，為后期的豬血液微生物多態性分析試驗做鋪墊以探索新的抗豬病原體等位基因，從而為SLA分子相關免疫研究提供理論依據。