Clostridium clariflavum GH10木聚糖酶的克隆表達、酶學性質及位點功能分析

王華廣，劉雨露，胡方覬，唐蕾,2*

1(江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

木質纖維素是豐富的可再生生物質資源，占地球所有可再生有機碳的1/3[1]。目前這部分潛在資源并未被有效開發利用，造成了生物質資源的極大浪費[2]。木聚糖是半纖維素的主要成分，如何降解木聚糖是利用半纖維素生物質資源的關鍵。木聚糖酶可以水解木聚糖中的糖苷鍵，把木聚糖降解成木糖或者低聚木糖。大多數木聚糖為雜多糖側鏈上含有不同的基團，如阿拉伯糖、乙酰基、阿魏酸殘基、4-O甲基葡萄糖醛酸基等[3]。因此完全水解木聚糖需要多種酶的共同作用，其中起重要作用的是β-1,4內切木聚糖酶。生物酶法催化有效率高和環境友好的優點，在工業應用中正在取代化學催化法。木聚糖酶主要應用在紡織、食品、飼料、造紙、木質纖維素生物質轉化等工業方面[4]。由于不同應用環境對酶有不同的要求，因此開發出適用于不同用途的木聚糖酶非常必要，目前采取的手段包括新酶的挖掘和酶的分子改造[5-7]。

根據蛋白的氨基酸序列、結構特征、底物的特異性、作用機制等理化性質的不同，木聚糖酶可分為6個糖苷水解酶家族：GH5、GH8、GH10、GH11、GH30、GH43，大多數木聚糖酶屬于GH10和GH11[8-9]。GH10家族木聚糖酶具有較大的分子質量(>30 kDa)、低等點電、廣泛的底物特異性、典型的(β/α)8桶折疊結構等特點[5,10]，是近幾年來研究與應用的熱點之一，如GH10家族新酶的尋找、非理性改造、理性設計、結構解析、作用機制、末端氨基酸的作用等方面[11-16]。

Clostridiumclariflavum是一種新發現的嗜熱厭氧木質纖維素降解菌，基因組學和蛋白質組學表明，C.clariflavum菌擁有豐富的木質纖維素降解酶系種類，在木質纖維素的降解方面有廣泛的應用潛力[17]。目前關于此菌來源的重組酶在國內外的研究鮮有報道。本課題組之前首次在大腸桿菌中克隆表達了C.clariflavum的一個雙催化域木聚糖酶基因Clocl-2441(結構域為GH11-CBM6-DockerinI-GHl0)，并初步研究了其酶學性質[18]。本研究將Clocl-2441中的單個GH10結構域構建到pET28a(+)載體上，研究其酶學性質，并通過分子改造發現209位點的組氨酸是酶活性的重要氨基酸，研究結果為具有雙催化域的木聚糖酶的分子改造和應用提供了依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與質粒

大腸桿菌(Escherichiacoli) JMl09、BL21(DE3)宿主菌株以及pET28a(+)、pET28a(+)-2441質粒均為實驗室所保藏。

1.1.2 酶與試劑

限制性內切酶(EcoR I，Hind III)、T4DNA連接酶、高保真DNA聚合酶、質粒提取試劑盒、蛋白定量試劑盒，均購自TaKaRa(大連)。山毛櫸木聚糖購自愛爾蘭Megazyme公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的克隆

重組木聚糖酶rXyn2441GH10的基因來自先前實驗室保存的含有C.clariflavum的一個雙催化域木聚糖酶基因Clocl-2441的重組質粒pET28a(+)-2441[18]。通過NCBI結構域序列分析將其中完整的GH10結構域進行引物設計，上游引物為：CCGGAATTCATTCCCTGCAGAAAATAATACAC，下游引物為：CCCAAGCTTCATTAATATTTCTTTCAATGCGTTG，擴增產物含有1 062 bp，表達蛋白含有353個氨基酸。以pET28a(+)-2441重組質粒為模板，利用PrimeSTAR MaxDNA Polymerase高保真DNA聚合酶擴增出完整目的基因片段。PCR反應條件為95 ℃預變性5 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸90 s，34個循環，最后72 ℃延伸10 min。

1.2.2 重組載體pET28a-Xyn2441GH10的構建

將保藏的含有pET28a(+)質粒的JM109菌株培養12～14 h后提取質粒。將擴增的目的產物片段和空載質粒用限制性內切酶EcoR I、Hind III在37 ℃下反應1 h，將雙酶切產物膠回收后測定核酸含量和純度。把載體和目的片段以1∶8的比例用T4DNA連接酶過夜連接，將連接產物用熱激法轉化入JM109感受態細胞。轉化后的重組子均勻涂布到含有100 μg/mL的卡那霉素固體LB培養基上，置于37 ℃培養箱中培養。挑取單菌落進行雙酶切驗證，將陽性重組質粒轉化入大腸桿菌BL21(DE3)后測序驗證。

1.2.3 重組木聚糖酶rXyn2441GH10的誘導表達及分離純化

將構建好的重組菌于37 ℃、200 r/min搖床上過夜培養，以4%的體積分數接種量轉接入含有100 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中，同樣條件下培養至OD600達到0.6～0.8，向培養基中加入終濃度為0.4 mmol/L的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)，25 ℃、200 r/min誘導表達10 h，離心收集菌體。將收集的菌體用磷酸緩沖液重新懸浮進行超聲破碎,離心收集上清，粗酶液用0.22 μm水系濾膜過濾后通過1 mL鎳柱進行純化(GE公司his-TrapTMHP)。把有酶活性的洗脫峰通過脫鹽柱(Sephadex G25)進行脫鹽，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl-sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)電泳鑒定純度，測定蛋白量和酶活。

1.2.4 重組木聚糖酶rXyn2441GH10的活性測定

將10 mg/mL的木聚糖底物與梯度稀釋后的酶液反應10 min后，用3,5-二硝基水楊酸(dinitrosalicylic acid，DNS)法測定還原糖(以木糖計)[19]。通過標準曲線計算還原糖量和相應的酶活性(3個平行取平均值)。酶活單位定義為:每分鐘水解木聚糖產生1 μmol還原糖所需的酶量為1 U。

1.2.5 重組木聚糖酶rXyn2441GH10的酶學性質

1.2.5.1 最適溫度

在0.1 mol的磷酸緩沖溶液(pH 6.5)條件下，45～85 ℃范圍內(梯度為5 ℃)檢測酶活性，以最高酶活為100%計算相對酶活。

1.2.5.2 最適pH

在pH 5.0～8.0(梯度為0.5)緩沖溶液和最適溫度條件下檢測不同pH下的酶活，以最高酶活為100%計算相對酶活。

1.2.5.3 溫度穩定性

將蛋白質量濃度為0.08 mg/mL的酶液，在55、60、65、70 ℃下處理不同的時間，在最適溫度和pH下檢測剩余酶活，以處理0 h的酶活為100%計算處理不同時間的剩余酶活。

1.2.5.4 pH穩定性

將酶液在pH 3.0～9.0范圍的緩沖溶液中于20 ℃下處理5 h，在最適條件下測定其剩余酶活，以未處理的酶活為100%計算不同pH處理后剩余酶活。

1.2.5.5 金屬離子及EDTA對重組木聚糖酶活性的影響

以Tris-HCl緩沖液配置不同金屬離子母液，按需添加至稀釋后的酶液中，分別考察了1 mmol/L和 5 mmol/L的 KCl、LiCl、CoCl2、MgCl2、MnCl2、CaCl2、FeCl3、AlCl3和EDTA 對rXyn2441GH10酶活的影響。在最適條件下檢測酶活，以未添加金屬離子和EDTA的酶活為100%計算酶活的變化。

1.2.6 重組木聚糖酶rXyn2441GH10的動力學參數測定

在酶的最適條件下測定不同底物濃度下的初始酶活，根據Lineweaver-Burk 雙倒數作圖。以底物1/[S]為X軸，1/[V]為Y軸作圖擬合出線性方程，計算不同底物的Km和Vmax以及其他參數。

1.2.7 重組木聚糖酶GH10結構域209位點飽和突變

通過全質粒PCR來引入19種氨基酸突變，在引物上設計突變位點以重組質粒為模板通過高保真酶擴增質粒全長，DpnI酶消化PCR產物去除模板后轉化入大腸桿菌BL21(DE3)感受態。挑選重組子測序確定正確的突變菌株。突變體菌株和rXyn2441GH10菌株在相同的條件(同1.2.3)誘導表達，控制菌體收集量一致，在相同的條件下測定rXyn2441GH10和突變酶的酶活。

2 結果與分析

2.1 目的基因的克隆與重組質粒的構建

以含有rXyn2441GH10木聚糖酶基因的質粒pET28a(+)-2441為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產物。電泳結果顯示，目的基因條帶單一，與理論1 062 bp大小符合(圖1)。

圖1 目的基因Xyn2441GH10的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of gene Xyn2441GH10

EcoR I和Hind III雙酶切法將擴增的目的基因插入pET28a(+)載體上。將構建的重組質粒轉化至E.coliBL21(DE3)中，雙酶切重組質粒后通過電泳驗證(圖2)。

圖2 重組質粒pET28a-Xyn2441GH10的雙酶切驗證Fig.2 Validation of recombinant plasmid by double enzyme digestion

1泳道有2條條帶，第1條與載體大小符合；第2條與Xyn2441GH10基因理論大小1 062 bp符合，說明基因成功插入正確位點。將菌液樣品送至華大基因測序。測序結果顯示，插入的基因序列與美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)上公布的C.clariflavumDSM 19732基因Clocl-2441序列( ID：11562857)的GH10結構域基因序列完全一致，且讀碼框正確，表明重組質粒構建成功。將重組木聚糖酶的GH10結構域氨基酸序列與不同種屬來源的GH10木聚糖酶氨基酸序列用DNAMAN比對分析，結果表明不同種屬來源的GH10木聚糖酶氨基酸序列比較保守，相似度為64.01%。GH10木聚糖酶在N末端的氨基酸的保守性較低比較靈活，相比之下C末端和中間部分氨基端保守性較強(圖3)。

1-Clostridium clariflavum; 2-Clostridium thermocellum; 3-Actinomadura meyerae; 4-Streptomyces olivaceoviridis; 5-Thermotoga maritime，黑色倒三角標示出推測的129位和240位催化氨基酸，黑色箭頭標示出209位點的組氨酸圖3 不同來源的GH10木聚糖酶氨基酸序列比對Fig.3 Amino acid sequence alignment of GH10 xylanase from different sources

2.2 重組木聚糖酶rXyn2441GH10的誘導表達及分離純化

將重組E.coliBL21(pET28a-Xyn2441GH10)菌株進行誘導表達分離純化(方法1.2.3)。把分別含有pET28a(+)的大腸桿菌、pET28a-Xyn2441GH10未誘導大腸桿菌、pET28a-Xyn2441GH10誘導后大腸桿菌上清酶液以及純化后酶液，取相同蛋白量進行SDS-PAGE蛋白電泳。對比空質粒(1泳道)、重組質粒未誘導(2泳道)、重組質粒誘導(3泳道)發現：第3泳道在44.3 kDa處有明顯的蛋白條帶與重組木聚糖酶理論大小43.8 kDa符合，表明目的蛋白成功表達并且為可溶性蛋白(圖4)。經過鎳柱純化和脫鹽處理后rXyn2441GH10達到了電泳純，可進行進一步的酶學性質分析。

M-marker; 1-pET28a(+); 2-pET28a-Xyn2441GH10 (-IPTG); 3-pET28a-Xyn2441GH10 (+0.4 mmol/L IPTG); 4-pET28a-Xyn2441GH10 (純化后)圖4 重組木聚糖酶rXyn2441GH10的SDS-PAGE電泳Fig.4 SDS-PAGE of recombinant xylanase rXyn2441GH10

2.3 木聚糖酶rXyn2441GH10的酶學性質

2.3.1 最適溫度

最適反應溫度結果如圖5所示。rXyn2441GH10的最適反應溫度是70 ℃，與rXyn2441最適溫度相同[18]。

圖5 重組木聚糖酶rXyn2441GH10的最適溫度Fig.5 The optimal reaction temperature for recombinant xylanase rXyn2441GH10

rXyn2441GH10在60 ～75 ℃之間酶活比較高，75 ℃以上酶活急劇下降，85 ℃時酶活僅為70 ℃時的19%，rXyn2441GH10屬于嗜熱木聚糖。如表1所示，大多數GH10木聚糖酶最適溫度在45 ～80 ℃之間，rXyn2441GH10木聚糖酶的最適溫度較高，為在較高溫度環境下的應用提供了新選擇。

2.3.2 最適pH值

最適反應pH結果如圖6所示。rXyn2441GH10的最適反應pH是7.0，在pH 6.0～7.5之間酶活為最適酶活的70%以上，在pH值小于5.5時其酶活下降較快，pH 5.0時的酶活僅為最適酶活的20%，屬于中性木聚糖酶。與rXyn2441的最適pH相比提高了0.5，雙結構域的最適pH不同可能是導致pH不同的原因[18]。不同來源的GH10木聚糖酶最適pH分布比較廣泛，大多在pH 4.0～9.0之間，rXyn2441GH10適合在pH 6.0～7.5 的環境中應用(表1)。

圖6 重組木聚糖酶rXyn2441GH10的最適pHFig.6 The optimal reaction pH for recombinant xylanase rXyn2441GH10

2.3.3 溫度穩定性

溫度穩定性結果如圖7所示。rXyn2441GH10在60 ℃及以下很穩定，在55、60 ℃處理6 h后剩余酶活為初始酶活的90%以上。rXyn2441GH10在65 ℃相比60 ℃穩定性有所下降，在處理6 h后酶活為初始酶活的38%。rXyn2441GH10在70 ℃下熱穩定性明顯降低，在處理1 h后酶活僅為初始酶活的17%。結果表明rXyn2441GH10在60 ℃及以下比較穩定，在70 ℃以及以上酶活穩定性降低。與多數不同來源的GH10木聚糖酶相比，rXyn2441GH10在65 ℃以下穩定性更強(表1)。

圖7 重組木聚糖酶rXyn2441GH10的溫度穩定性Fig.7 The thermostability for recombinant xylanase rXyn2441GH10

2.3.4 pH穩定性

pH穩定性結果如圖8所示。rXyn2441GH10在pH 4.0～9.0之間都比較穩定，在該條件下處理5 h后其剩余酶活在84%以上。在pH 3.0環境下處理5 h后剩余酶活急劇下降僅為初始酶活的22%，有可能在該pH下對酶活性中心影響很大。rXyn2441GH10在中性偏酸性的環境下pH穩定性最好，與已知的GH10木聚糖酶相比pH穩定性范圍更寬，適合的應用范圍更廣泛(表1)。

2.3.5 金屬離子和EDTA對rXyn2441GH10的影響

結果如表2所示。K+、Ca2+、Mg2+、Al3+和Fe3+對rXyn2441GH10酶活有促進作用，其中5 mmol/L的Mg2+使的酶活提高了79.2%。Li+、Co2+和Mn2+對酶活有抑制作用，5 mmol的Co2+使酶活降低到58.3%。EDTA對酶活有微弱的促進作用。其中較高的金屬離子濃度對rXyn2441GH10影響比較大，與NCBI數據表明蛋白存在較多金屬離子結合位點一致[20]，可能是金屬離子與酶的結合進而影響了其的活性。以上結果對rXyn2441GH10的應用有重要的指導作用。

2.4 rXyn2441GH10的動力學參數

通過1.2.6方法測定數據用Origin 9.0作圖擬合線性方程，櫸木木聚糖底物擬合方程是Y=0.001 5X+0.000 591(R2=0.992)，甘蔗渣木聚糖底物擬合方程是Y=0.001 6X+0.001 7(R2=0.992)。根據線性方程計算動力學參數(表3)，相比之下重組酶水解櫸木木聚糖效率更高，且與文獻總結的不同來源的GH10木聚糖酶相比有更大的Vmax和kcat，但對羧甲基纖維素鈉沒有活性，與文獻報道相一致[21-22]。

2.5 重組木聚糖酶209位點組氨酸的定點飽和突變

通過全質粒PCR引入突變的方法，將209位點的組氨酸突變成其他19種氨基酸。測序結果比對分析表明，209位點的組氨酸被成功突變成19種氨基酸。測定rXyn2441GH10和突變酶的酶活，以rXyn2441GH10酶活為100%作圖，結果表明19個突變體對山毛櫸木聚糖降解活性喪失或者幾近喪失，活性最高的突變體H209S僅為rXyn2441GH10的0.17%(圖9)。說明209位點的組氨酸對酶活性有很大的影響。

表3 重組木聚糖酶rXyn2441GH10動力學參數Table 3 The kinetic parameters of the recombinant xylanase rXyn2441GH10

圖9 rXyn2441GH10的209位點飽和突變對酶活性的影響Fig.9 Effect of 209 site-saturation mutagenesis on activity of the recombinant xylanase rXyn2441GH10

為了研究突變體酶活變化是不是二級結構變化引起的，通過圓二色性光譜分析了H209N突變體和rXyn2441GH10的二級結構(圖10)。

圖10 重組木聚糖酶rXyn2441GH10和H209N突變酶的圓二色性光譜Fig.10 The circular dichromatic spectrum of recombinant xylanase rXyn2441GH10 and its H209N mutant

結果表明，H209N突變體和rXyn2441GH10在二級結構上沒有發生變化，突變后酶活的變化不是二級結構變化引起的。將不同來源的GH10木聚糖酶的氨基酸序列比對分析(圖3)，箭頭標注的組氨酸和倒三角標注的2個谷氨酸在所有GH10結構域中非常保守，且這3個氨基酸周圍的氨基酸同樣很保守。rXyn2441GH10與同屬菌Clostridiumthermocellum來源的GH10木聚糖酶XynZ氨基酸序列相似度為63%，且XynZ晶體結構已經解析。在XynZ中2個保守的谷氨酸為催化氨基酸，209位點的組氨酸在結構中位于酶的催化裂口處，與2個催化氨基酸Glu相鄰可與催化殘基產生氫鍵作用，使得2個谷氨酸在空間結構保持異頭構象完成催化[23]。在rXyn2441GH10中209位點的His有可能起到類似的作用，209位點突變成其他的氨基酸后導致異頭構象不穩定使得催化效率大大降低甚至喪失。

3 結論

Clostridiumclariflavum菌株可產生多種木質纖維素降解酶類，在木質纖維素降解方面有廣泛的應用潛力。目前國外對C.clariflavum菌株來源的木質纖維素降解酶類主要關注在以纖維小體為中心的復合酶的作用機制以及應用，但對單個酶或單個結構域性質研究很少，對工業應用指導作用有限[18,24]。本實驗成功克隆了Clocl-2441上GH10結構域木聚糖酶基因并在大腸桿菌中表達為可溶性蛋白。酶學性質研究表明該酶的最適反應溫度為70 ℃，最適pH值為7.0，屬于中性嗜熱木聚糖酶。rXyn2441GH10適合在55～65 ℃、pH 6.0～7.5條件下應用，與已報道的部分GH10木聚糖酶相比具有更廣泛的應用適應性。209位點的組氨酸是rXyn2441GH10活性的關鍵氨基酸，并且在GH10結構域中極其保守，對GH10木聚糖酶的位點分析和改造有指導意義。本研究結果為重組GH10木聚糖酶的研究及工業應用提供了一定的理論依據。