固相萃取-氣相色譜-火焰光度法同時測定植物性肽粉中42種有機磷農藥殘留

安紅梅，柯潤輝*，王麗娟，楊春艷，黃新望，田菲菲，尹建軍

1(中國食品發酵工業研究院, 北京，100015) 2(島津企業管理(中國)有限公司, 北京，100020)

植物性肽粉是植物蛋白(如大豆蛋白、玉米蛋白等)的水解產物，經后續處理、精煉后得到的低肽混合物，具有抗菌、抗氧化、抗疲勞、調節免疫、血管緊張素轉換酶抑制作用等眾多的生理活性[1-3]，被廣泛應用在功能飲料、保健品、功能食品及醫用食品領域，是當今保健食品和生物醫藥領域的研究熱點之一[4]。目前對肽的研究多集中在其生物功效與作用方面[2, 5]，而對其安全指標的研究還較少。由于大豆、玉米等農作物在種植過程中不可避免地會使用化學農藥，由此所帶來的農藥殘留問題不容小覷。經文獻查詢，國內尚未見到有關植物性肽粉及制品中農藥殘留研究的報道。為保障植物性肽粉的食用安全性，避免因農藥殘留問題給消費者的健康和行業聲譽帶來損害，同時為完善肽生產企業質量安全控制體系，有必要開發適用于植物性肽粉及制品中簡單、高效、通用性強的農藥日常監測方法。

有機磷農藥是用于防治植物病蟲害應用量最大，應用面最廣的農藥品種之一，多數屬劇毒或高毒類，對人體有極大的危害[6]。研究表明，有機磷農藥經過皮膚、呼吸以及腸胃吸收等途徑進入人體后，會危害中樞神經系統從而出現急性中毒癥狀或者慢性累積效應[7]。目前，有機磷農藥的檢測方法主要有氣相色譜法(GC)[8]、氣相色譜-質譜法[9]、氣相色譜-三重四極桿串聯質譜法[10]、酶聯免疫法(ELISA)[11]、液相色譜-串聯質譜法[12]等。質譜法雖具有較高的靈敏度， 但其檢測投入大、 運行成本高、 對使用人員的素質要求亦較高[13]；ELISA法雖特異性較強，但酶制劑易失活容易導致反應不穩定、重復性差[14]；氣相色譜-火焰光度檢測器(FPD)法具有選擇性強、靈敏度高、穩定性好，受基質效應影響較小、儀器成本較低且普及率高等優點，因此廣泛應用于有機磷農藥的殘留分析中。本文應用乙腈作為提取溶劑，經石墨化炭黑氨基復合SPE柱凈化，氣相色譜-火焰光度法檢測，建立了同時測定植物肽粉中42種有機磷農藥的方法，操作簡單，靈敏度高，能夠滿足植物肽粉及其制品中有機磷農藥殘留的檢測和日常監控的需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙酸乙酯、甲苯、乙腈、正己烷和丙酮(均為色譜純)，美國J.T.Baker公司；NaCl(分析純),國藥集團化學試劑有限公司；弗羅里硅土(Florisil)固相萃取柱、石墨化炭黑-氨基復合固相萃取柱(500 mg/6 mL), 天津博納艾杰爾科技有限公司。

有機磷農藥標準溶液：敵敵畏、速滅磷、乙酰甲胺磷、蟲線磷、異吸硫磷、甲拌磷、氧樂果、特丁硫磷、百治磷、巴胺磷(胺丙磷)、八甲磷、乙拌磷、磷胺、樂果、甲基對硫磷、對氧磷、地毒磷、毒死蜱、馬拉硫磷、嘧啶磷、倍硫磷、水胺硫磷、滅蚜磷、喹硫磷、氯唑磷、稻豐散、抑草磷、殺蟲畏、苯線磷、乙拌磷砜、滅菌磷、乙硫磷、硫丙磷、三硫磷、敵瘟磷、三唑磷、苯硫磷、苯線磷亞砜、 莎陴磷、溴苯磷、亞胺硫磷、吡菌磷(100 mg/L，農業部環境保護科研監測所)。

3個玉米肽粉，2個大豆肽粉，2個山藥肽粉，3豌豆肽粉，共10個樣品，購自當地藥店、超市。

1.2 儀器與設備

氣相色譜儀(GC-2010 PLUS，配有FPD檢測器)，日本島津公司；氮氣吹干儀(DC-12)，上海安譜實驗科技股份有限公司；數控超聲波清洗器(KQ5200 DB)，昆山市超聲儀器有限公司；旋轉蒸發儀(RE-52AA)，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 標準溶液的配制

分別準確移取上述42種有機磷農藥標準儲備液0.2 mL，用甲苯定容至10 mL，得到質量濃度為2 mg/L的混合標準中間溶液，0～4 ℃保存備用。使用前移取適量的混合標準中間溶液，用甲苯逐級稀釋成適當濃度的混合標準使用液。

1.4 樣品制備

1.4.1 提取

稱取植物性肽粉試樣10.00 g于50 mL具塞離心管中，加入40 mL乙腈(對比實驗為等量的丙酮、乙酸乙酯)和5 g NaCl，劇烈振蕩5 min，超聲30 min，6 000 r/min離心6 min，準確取出20 mL上清液于50 mL雞心瓶中，于38 ℃旋轉蒸發至2 mL，待凈化。

1.4.2 凈化

石墨化炭黑-氨基復合柱凈化：用5 mL乙腈-甲苯(體積分數為75%)潤洗石墨化炭黑-氨基復合固相萃取小柱，保持柱體濕潤，將上述提取濃縮液上柱，收集流出液，再用5 mL乙腈-甲苯(體積分數為75%)洗滌雞心瓶，并上柱，再加入20 mL乙腈-甲苯(體積分數為75%)洗脫液，保持流速1 mL/min，合并流出液，于38 ℃水浴旋轉蒸發至近干，用1mL甲苯溶解，上GC-FPD檢測。

Florisil固相萃取柱凈化：分別用丙酮-正己烷(體積分數為10%) 和正己烷5 mL潤洗Florisil固相萃取柱，保持柱體濕潤。將上述提取濃縮液氮吹干，用2 mL正己烷復溶，上柱，收集流出液，再用5 mL丙酮-正己烷(體積分數為10%)洗滌雞心瓶，并上柱，再加入5 mL丙酮-正己烷(體積分數為10%)洗脫液，保持流速1 mL/min，合并流出液，于38 ℃水浴旋轉蒸發至近干，用1 mL甲苯溶解，上GC-FPD檢測。

1.5 氣相色譜條件

色譜柱為DB-17MS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國安捷倫J&W公司)；載氣為高純度氮(純度99.999%)；恒流模式，柱流速為1.00 mL/min；進樣口溫度250℃；無分流進樣，進樣量1 μL；FPD檢測器溫度300 ℃，氫氣流量為62.5 mL/min；空氣流量為90.0 mL/min。

升溫程序：初始溫度100 ℃，保持2 min，以8 ℃/min的速率升至210 ℃，以5 ℃/min的速率升至260 ℃，保持8 min，以8 ℃/min的速率升至280 ℃，保持3 min，總運行時間為39 min。

2 結果與分析

2.1 前處理方法的優化

2.1.1 提取溶劑的確定

在提取過程中，提取溶劑的選擇會直接影響待測物的回收率。通過查閱相關文獻[15-17]，同時結合有機磷農藥的溶解性，實驗比較了丙酮、乙腈、乙酸乙酯作為肽粉中有機磷農藥的提取劑，對3種提取劑的加標回收率進行比較。實驗結果表明，用乙腈提取時各農藥的回收率為79.5%～101.3%，明顯高于乙酸乙酯(回收率為52.9%～78.1%)(圖1)。用丙酮的提取時各農藥的回收率為75.6%～93.6%，與乙腈相差不大，但是其共提取的雜質相對較多，故實驗最后選擇為乙腈作為提取溶劑。

2.1.2 固相萃取條件的選擇

Florisil柱、C18柱、石墨化炭黑/氨基復合柱(PestiCarb/NH2柱)是農殘分析常用的固相萃取凈化柱，其中PestiCarb/NH2固相萃取柱上層是活性炭，脫色效果明顯，下層氨基能和糖類、蛋白質、脂肪中的相關基團形成氫鍵從而去除基質中的大部分干擾物[18]；C18柱主要可去除基質中脂肪等非極性雜質[19], 但由于植物肽粉樣品中多為氨基酸組成的低肽段，脂肪含量較低，故無需用C18柱凈化。試驗比較了Florisil柱和PestiCarb/NH2固相萃取柱凈化試樣對回收率的影響。結果表明: Florisil柱和PestiCarb/NH2固相萃取柱在有機磷農藥的凈化方面效果相當，平均回收率分別為86.6%和90.2%，但由于Florisil柱在凈化過程中某些農藥，如氯唑磷、甲基對硫磷、吡菌磷等農藥的平均回收率偏低(分別為71.1%、80.8%和72.0%)，與使用PestiCarb/NH2柱相比有一定差距(平均回收率分別為88.7%、103.8%和85.6%)(圖2)，同時使用PestiCarb/NH2柱凈化后的溶液顏色比使用Florisil柱淺，除色素的能力較強。因此，最終選擇PestiCarb/NH2柱作為固相萃取凈化柱。

2.2 方法的基本性能

2.2.1 線性范圍及測定低限

使用玉米肽粉作為代表，取其空白樣品提取溶液作為基質匹配標準溶液的稀釋液, 將2 mg/L 的混合標準中間液逐級稀釋至濃度為1.00、0.50、0.20、0.10、0.05 mg/L的基質匹配混合標準溶液進行測定, 以質量濃度對相應的峰面積繪制標準曲線, 求得線性方程及相關系數。在0.05～1.00 mg/L范圍內線性關系良好, 相關系數R2大于0.99。以S/N=3計算方法中各種有機磷農藥的檢出限(LOD)，其范圍為0.005～0.02 mg/kg；以S/N=10作為分析方法的定量低限，其范圍為0.015～0.060 mg/kg，見表1。圖3為濃度為0.10 mg/L的42種有機磷農藥基質匹配標準溶液的GC-FPD譜圖。

表1 42種有機磷農藥的線性范圍、相關系數、檢出限Table 1 The retain time, linear range, correlation coefficient, and detection limit of 42 organophosphorus pesticides

續表1

名稱保留時間/min線性方程線性范圍/(mg·L-1)相關系數檢出限/(mg·kg-1)定量限/(mg·kg-1)磷胺216.079Y=3.6×105X+6 2580.05～1.000.993 60.0180.054甲基對硫磷16.571Y=2.9×106X+30 5440.05～1.000.999 30.0050.015對氧磷16.644Y=1.4×106X+25 5500.05～1.000.999 60.0100.030地毒磷16.847Y=2.5×106X+10 2780.05～1.000.999 40.0050.015毒死蜱16.986Y=2.7×106X+50 0020.05～1.000.999 10.0050.015馬拉硫磷17.126Y=2.3×106X+33 6120.05～1.000.999 30.0080.024嘧啶磷17.298Y=2.6×106X+10 2110.05～1.000.998 90.0050.015倍硫磷18.069Y=2.7×106X+30 2780.05～1.000.999 60.0050.015水胺硫磷18.65Y=2.5×106X+20 5890.05～1.000.999 50.0080.024滅蚜磷18.914Y=2.5×106X+35 7840.05～1.000.995 60.0080.024喹硫磷19.307Y=2.5×106X+68 4510.05～1.000.999 60.0080.024氯唑磷19.509Y=2.4×106X+20 3890.05～1.000.999 30.0080.024稻豐散19.591Y=1.5×106X+50 2230.05～1.000.999 10.0120.036抑草磷19.977Y=2.5×106X+20 3640.05～1.000.999 40.0080.024殺蟲畏20.133Y=1.8×106X+56 9410.05～1.000.999 30.0100.030苯線磷20.503Y=1.5×106X+10 3690.05～1.000.999 20.0120.036乙拌磷砜21.08Y=1.4×106X+36 9980.05～1.000.996 30.0120.036滅菌磷21.223Y=2.5×106X+40 2810.05～1.000.999 10.0080.024乙硫磷22.232Y=2.8×106X+13 7990.05～1.000.999 50.0050.015硫丙磷23.067Y=2.2×106X+44 1150.05～1.000.997 20.0100.030三硫磷23.458Y=1.4×106X+28 9940.05～1.000.999 20.0150.045敵瘟磷24.502Y=5.0×105X+5 2440.05～1.000.999 60.0150.045三唑磷25.045Y=1.4×106X+45 8790.05～1.000.999 30.0150.045苯硫磷27.435Y=1.1×106X+23 6600.05～1.000.999 70.0150.045苯線磷亞砜28.128Y=3.0×105X+6 2310.05～1.000.999 00.0180.054莎陴磷29.028Y=6.0×105X+5 8770.05～1.000.997 20.0150.045溴苯磷29.635Y=7.0×105X+6 3000.05～1.000.998 50.0150.045亞胺硫磷30.348Y=6.0×105X+8 0990.05～1.000.999 10.0150.045吡菌磷31.017Y=7.0×105X+4 0560.05～1.000.998 90.0150.045

圖3 42種有機磷農藥的GC-FPD譜圖(0.10 mg/L)Fig.3 GC-FPD chromatogram of 42 organophosphorus pesticides(0.10 mg/L)1-敵敵畏；2-速滅磷；3-乙酰甲胺磷；4-蟲線磷；5-異吸硫磷；6-甲拌磷；7-氧樂果；8-特丁硫磷；9-百治磷；10-巴胺磷(胺丙磷)；11-八甲磷；12-乙拌磷；13-磷胺1；14-樂果；15-磷胺2；16-甲基對硫磷；17-對氧磷；18-地毒磷；19-毒死蜱；20-馬拉硫磷；21-嘧啶磷；22-倍硫磷；23-水胺硫磷；24-滅蚜磷；25-喹硫磷；26-氯唑磷；27-稻豐散；28-抑草磷；29-殺蟲畏；30-苯線磷；31-乙拌磷砜；32-滅菌磷；33-乙硫磷；34-硫丙磷；35-三硫磷；36-敵瘟磷；37-三唑磷；38-苯硫磷；39-苯線磷亞砜；40-莎陴磷；41-溴苯磷；42-亞胺硫磷；43-吡菌磷

2.2.2 回收率和精密度實驗

為考察方法的準確性, 按照所確定的方法，選取某一空白玉米肽粉樣品在相應線性范圍內進行2個水平的添加回收率試驗，每個水平做6 個平行樣品測定。結果表明，玉米肽粉中42種有機磷平均回收率均在72.8%～103.8%，相對標準偏差(RSD)范圍為2.44%～8.71%(表2)，該方法的回收率和RSD均符合檢測要求[20]。

2.3 實際樣品分析

為驗證方法的可行性，采用實驗建立的方法對10種市售植物肽粉樣品(3玉米肽粉，2個大豆肽粉，2個山藥肽粉，3豌豆肽粉)進行分析。若為陽性樣品，需經極性不同色譜柱進行雙柱檢驗或質譜確證。實驗結果表明，10種植物性肽粉中42種有機磷農藥均未檢出，在一定程度上說明市面上植物性肽粉質量具有可靠性。

表2 42種有機磷農藥的回收率及其精密度(n=6)Table 2 Spiked recoveries and RSD of 42 organophosphorus pesticides (n=6)

續表2

名稱添加濃度0.05 mg/kg添加濃度0.5 mg/kg平均回收率/%RSD/%平均回收率/%RSD/%乙酰甲胺磷72.86.3178.98.71蟲線磷88.24.6189.13.01異吸硫磷80.34.0290.22.98甲拌磷90.64.1893.12.73氧樂果80.65.0382.68.59特丁硫磷89.73.9988.13.05百治磷88.74.2290.63.66胺丙畏(巴胺磷)91.54.3691.62.87八甲磷90.83.8992.13.66乙拌磷84.64.3988.72.85磷胺177.46.0780.37.94樂果92.45.8490.66.05磷胺276.76.7177.68.13甲基對硫磷81.44.06103.83.16對氧磷94.63.6992.52.44地毒磷89.14.7890.62.69毒死蜱91.53.6998.73.14馬拉硫磷93.74.1293.52.85嘧啶磷88.13.6485.72.89倍硫磷82.64.8980.63.61水胺硫磷90.85.0194.44.01滅蚜磷84.65.3390.33.75喹硫磷91.74.2394.82.99氯唑磷88.75.6492.63.33稻豐散93.13.1890.82.45抑草磷84.54.5585.13.82殺蟲畏85.63.8984.93.01苯線磷90.54.2188.73.46乙拌磷砜76.73.6998.32.89滅菌磷88.33.4795.63.01乙硫磷80.53.8490.72.55硫丙磷92.64.0392.32.59三硫磷86.15.0189.43.75敵瘟磷84.33.6688.62.86三唑磷85.74.0591.33.06苯硫磷82.13.6685.62.57苯線磷亞砜82.33.7887.43.16莎陴磷90.64.0890.63.06溴苯磷85.84.6688.14.02亞胺硫磷79.43.7982.63.19吡菌磷78.35.0485.63.38

3 結論

本文建立了植物性肽粉中同時測定42種有機磷農藥的GC-FPD分析方法，通過乙腈提取，PestiCarb/NH2固相萃取柱凈化，在選定的色譜條件下可以實現植物肽粉中42種有機磷農藥的分離與定量。該方法在0.05～1.00 mg/L范圍內線性關系良好, 相關系數R2大于0.99，最低檢出限為0.005～0.020 mg/kg；在0.05～0.5 mg/kg 的添加水平，42種有機磷的平均回收率在72.8%～103.8%，相對標準偏差在2.44%～8.71%，該方法具有良好的回收率和精密度，可用于植物性肽粉及其制品中有機磷農藥的檢測，且能夠滿足我國食品中農藥殘留限量標準GB 2763—2014的檢測需求。