釀酒酵母合成番茄紅素的適配性優化

李霞，趙金雨，婁興丹，張根林

(石河子大學 化學化工學院，新疆兵團化工綠色過程重點實驗室，新疆 石河子，832003)

番茄紅素(lycopene)是一種抗氧化活性很強的萜類物質，具有猝滅單線態氧、清除自由基、抑制脂質過氧化等多種生理功能活性[1-2]，在癌癥預防，抗衰老，保護心腦血管和增強機體免疫力等方面有廣泛應用，被世界衛生組織(WHO)和聯合國糧農組織(FAO)認定為A類營養素，市場前景較好[3-4]。目前生產番茄紅素常用的方法有直接提取法、化學合成法和微生物發酵法。由于原料番茄的供應受到氣候與季節的影響，使得直接提取法生產成本較高[5]。化學合成法一般以β-紫羅酮為原料，合成過程步驟繁瑣，且化學試劑殘留問題限制了產品的使用范圍[6]。而微生物發酵法由于不受氣候和季節影響、生產周期短、易于大規模培養等優勢逐漸受到人們的關注。釀酒酵母因具有遺傳可操作性以及成熟的大規模培養技術使其在食品工業中被廣泛應用[7-8]。作為安全的模式微生物，釀酒酵母存在能合成萜類的甲羥戊酸(MVA)途徑，已經作為生產青蒿酸[9]、玉米黃質[10]、β-香樹脂醇[11]、人參皂苷[12]等天然產物的優良宿主使用。通過引入外源的八氫番茄紅素合成酶(CrtB)、八氫番茄紅素去飽和酶(CrtI)可以實現在釀酒酵母中合成番茄紅素[13](圖1)。如YAMANO等將歐文氏菌的番茄紅素合成基因引入釀酒酵母中，獲得了產量為113 μg/g番茄紅素[13]；王貝貝等將紅法夫酵母的CrtBY和CrtI基因導入釀酒酵母，番茄紅素的產量達到0.4 mg/g[14]；施明雨等將成團泛菌來源的番茄紅素合成基因引入釀酒酵母后，番茄紅素產量達到13.23 mg/L[15]。研究認為，合成途徑與宿主的適配性、宿主的生理狀態仍然是限制番茄紅素高效合成的重要因素，難以進行全局調控[13-15]。因此，本研究從宿主選擇、途徑表達的適配性等方面綜合考慮，研究底盤宿主、啟動子以及前體物庫容對番茄紅素合成與細胞生長的影響，為進一步優化釀酒酵母合成番茄紅素提供參考。

ERG10-乙酰乙酰輔酶A轉移酶基因；ERG13-HMG輔酶A合酶基因；tHMG1-HMG輔酶A還原酶基因；ERG12-甲羥戊酸激酶基因；ERG8-磷酸甲羥戊酸激酶基因；ERG19-磷酸甲羥戊酸脫羧酶基因；IDI-IPP異構酶基因；ERG20-FPP合酶基因；BTS1-GGPP合酶基因； CrtB-八氫番茄紅素合酶基因；CrtI-八氫番茄紅素脫氫酶基因圖1 釀酒酵母合成番茄紅素的途徑優化策略Fig.1 Strategy for construction of lycopene biosynthetic pathway

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器

高保真PrimeSTAR HS DNA聚合酶、RNA反轉錄試劑盒、實時熒光定量試劑盒PCR試劑盒、限制性內切酶SalI、BamH I購自大連寶生物工程有限公司；核酸Marker、質粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒、酵母DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；氨芐青霉素、潮霉素、G418、半乳糖、番茄紅素標準品購自索萊寶生物科技有限公司。

T100型PCR儀，Bio-Rad公司；LightCycler 96型熒光定量PCR儀，瑞士Roche公司；MLS33750型高壓滅菌器，日本三洋公司；5810R型高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；LC-A10型液相色譜儀，日本島津公司；GC2010型氣相色譜儀，日本島津公司。

1.1.2 培養基

LB培養基：酵母浸出粉5 g/L、蛋白胨10 g/L和NaCl 10 g/L。固體培養基添加15 g/L的瓊脂粉。LB培養基用于大腸桿菌的培養。

BMMY培養基：酵母浸出粉10 g/L、蛋白胨20 g/L和半乳糖20 g/L。固體培養基添加20 g/L的瓊脂粉。BMMY培養基用于含有誘導型啟動子釀酒酵母工程菌的培養。

YPD培養基：酵母浸出粉10 g/L、蛋白胨20 g/L和葡萄糖20 g/L。固體培養基添加20 g/L的瓊脂粉。YPD培養基用于釀酒酵母的培養。

畢宏生是第十二屆、十三屆全國人大代表，著名眼科專家，從事眼科臨床、教學及科研工作30多年，在白內障、視光及采用眼顯微外科手術解決復雜疑難性眼病、中西醫結合眼病的臨床及研究領域均取得突出成就。他還高度關注民生工程，注重承擔社會職責，連續多年為防盲治盲奔波勞力，多次協助政府推動重大公共衛生項目。活動中，畢宏生不僅介紹了眼科常見病保健知識，還積極呼吁全社會要高度重視眼健康，關注青少年視力保健。

1.1.3 菌種與質粒

研究所需的菌種與質粒見表1。

表1 菌種和質粒Table 1 The strains and plasmids

1.2 方法

1.2.1 表達載體和酵母工程菌的構建

以釀酒酵母基因組為模板，利用特異性引物擴增啟動子GAL1p、GAL7p、TEF1p、FBA1p和終止子CYC1t、TYS1t。以質粒pUC57-CrtB和pUC57-CrtI為模板，擴增分別獲得來源于歐文氏菌的八氫番茄紅素合成酶基因CrtB(GenBank: KC954270.1)和來源于紅法夫酵母的八氫番茄紅素脫氫酶基因CrtI(GenBank:AY177424.1)。然后通過重疊延伸PCR方法構建獲得基因表達盒GAL1p-CrtB-CYC1t、GAL7p-CrtI-TYS1t、TEF1p-CrtB-CYC1t和FBA1p-CrtI-TYS1t。用限制性內切酶SalI和BamH I對質粒pRS41H和pRS42K進行線性化。線性化的質粒和基因表達盒通過醋酸鋰轉化法轉化到釀酒酵母中，利用釀酒酵母的同源重組實現組裝[16]，形成含有不同表達途徑質粒的工程酵母(表2)。為了平衡釀酒酵母MVA途徑的庫容，選擇rDNA重復單元序列作為MVA途徑基因表達盒的整合位點，設計了如圖2的構建策略，形成工程酵母W5和W6(表2)。

ADH1p、ALA1p、FBA1p、TDH3p、TYS1p、GPM1p、TEF1p-啟動子；SDH2t、ILV1t、VPS8t、PIM1t、REI1t、LRP1t、 CYC1t-終止子，hphNT1-潮霉素B抗性篩選標記基因圖2 MVA途徑優化設計示意圖Fig.2 Schematic diagram of MVA pathway optimization

1.2.2 酵母工程菌的篩選

利用pRS41H或pRS42K為載體、使用半乳糖誘導型啟動子GAL1p和GAL7p控制番茄紅素合成途徑時，轉化所得的酵母工程菌使用BMMY抗性培養基培養；利用pRS41H或pRS42K為載體、使用組成型啟動子TEF1p和FBA1p控制番茄紅素合成途徑時，轉化所得的酵母工程菌使用YPD抗性培養基培養。轉化后的細胞均置于30 ℃培養箱中倒置培養，直至長出菌落，經菌落顏色變化(合成番茄紅素的菌株顯粉紅色)和菌落PCR篩選獲得陽性克隆菌株。

1.2.3 酵母工程菌的發酵

1.2.4 番茄紅素的提取

菌株發酵結束后，采用改進的XIE等提取類胡蘿卜素的方法[17]。取發酵液50 mL轉入離心管中，8 000 r/min離心5 min棄上清，無菌水清洗沉淀2次后加入10 mL 3 mol/L的HCl溶液，混合均勻后沸水浴4 min，迅速放入冰水浴冷卻3 min，8 000 r/min離心5 min棄去上清，無菌水清洗沉淀2次后倒掉上清，加入10 mL丙酮，并加少量石英砂渦旋混合細胞5 min，最后充分萃取脂溶性代謝產物，8 000 r/min離心5 min，上清液用0.22 μmol/L有機濾膜過濾后用高效液相色譜儀分析番茄紅素的含量。

1.2.5 番茄紅素的測定

使用高效液相色譜儀對番茄紅素進行定量測定。所用液相色譜儀為島津LC-10A，檢測器為PDA檢測器，色譜柱為ODS-3(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，流動相為V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(二氯甲烷)=21∶21∶8，流速1.0 mL/min，進樣量10 μL，柱溫30 ℃，檢測波長470 nm。每個待測樣品平行測定3次。

1.2.6 中間代謝產物的提取及測定

釀酒酵母中角鯊烯、法尼醇等代謝產物的提取參照文獻報道進行[18]。使用氣相色譜儀進行測定。所用氣相色譜儀為島津GC2010，色譜柱為 TG-5MS(Thermo 30 m×0.25 mm×0.25 μm)，FID檢測器溫度為300 ℃，分流進樣，載氣為氮氣，進樣量1 μL，分流比30∶1，進樣口溫度為250 ℃，柱箱程序升溫起始溫度 80 ℃，然后以20 ℃/min 的速度升溫至300 ℃，保持40 min。

2 結果與分析

2.1 底盤宿主對番茄紅素途徑表達的影響

以單拷貝質粒pRS41H為表達載體，使用誘導型啟動子GAL1p和GAL7p控制番茄紅素合成途徑，分別轉化S.cerevisiaeINVSc1和CEN.PK2-1C，獲得釀酒酵母工程菌W1和W2，搖瓶發酵后提取產物，用HPLC進行定性和定量分析。結果顯示，盡管在不同底盤宿主中導入番茄紅素合成途徑后，菌株的生物量差別不大，但合成番茄紅素的水平有較大區別。以釀酒酵母INVSc1為底盤宿主時，番茄紅素最高產量為0.025 mg/L，以釀酒酵母CEN.PK2-1C為底盤宿主時，番茄紅素最高產量為0.052 mg/L，是INVSc1為底盤宿主的2倍(如圖3所示)。說明釀酒酵母CEN.PK2-1C較釀酒酵母INVSc1更適合作為底盤宿主合成番茄紅素，不同釀酒酵母菌株的遺傳背景對目標產物合成有一定的影響，這一結果與WESTFALL等通過釀酒酵母合成青蒿二烯的研究相似[19]，可能與CEN.PK株系具有更清楚的生理特點和有較強的合成萜類化合物前體的能力有關[20]。

圖3 底盤宿主對工程菌合成番茄紅素的影響Fig.3 Effect of chassis hosts on lycopene production by engineered S. cerevisiae

2.2 拷貝數對番茄紅素途徑表達的影響

為了研究基因拷貝數對途徑表達效果的影響，以釀酒酵母CEN.PK2-1C為底盤宿主，在其中轉入含有番茄紅素合成途徑的多拷貝質粒pRS42K，構建獲得釀酒酵母工程W3。分析顯示，拷貝數對工程菌株的生長影響也較小，但對產物合成具有一定的影響。使用單拷貝質粒pRS41H時，番茄紅素的最高產量為0.052 mg/L，而使用多拷貝質粒pRS42K時，番茄紅素產量可達到0.078 mg/L，產量提高了1.5倍(如圖4所示)。說明番茄紅素的產量與途徑表達所用載體的類型有一定關系，功能基因的拷貝數影響了外源途徑的表達，由多拷貝質粒pRS42K表達番茄紅素合成途徑時與酵母底盤的適配性更好。

圖4 拷貝數對工程菌合成番茄紅素的影響Fig.4 Effect of copy number on lycopene production by engineered S. cerevisiae

2.3 啟動子類型對番茄紅素途徑表達的影響

以多拷貝質粒pRS42K為表達載體，使用組成型啟動子(TEF1p、FBA1p)調控番茄紅素合成途徑，轉化釀酒酵母底盤CEN.PK2-1C獲得了釀酒酵母工程菌W4，研究啟動子對途徑表達效果的影響。結果顯示，當番茄紅素合成基因以組成型啟動子控制表達時，番茄紅素產量可達到0.152 mg/L，產量提高了2倍，但對菌株生長具有一定的影響，相比初始菌株，生物量有顯著下降(如圖5所示)。

圖5 啟動子類型對工程菌合成番茄紅素的影響Fig.5 Effect of promoters on lycopene production by engineered S. cerevisiae

據文獻報道，較誘導型啟動子，組成型啟動子在酵母合成其他萜類化合物如紫衫二烯時也具有一定優勢[21]，組成型啟動子可能更適合釀酒酵母中途徑的平衡表達。

2.4 平衡前體物供應提高番茄紅素的合成

前期研究發現，導入番茄紅素或其他外源合成途徑后，酵母自身代謝平衡受到干擾，導致前體物供應不足[22]。為了優化番茄紅素生物合成工程菌中的前體物供應，將MVA途徑合成模塊轉化到釀酒酵母工程菌W4中，獲得工程菌W5。結果顯示，強化酵母工程菌MVA途徑后，工程菌W5的番茄紅素產量達到了3.62 mg/L，較工程菌W4提高了24倍(如圖6所示)，是初始工程菌株的70倍。

圖6 前體物供應對番茄紅素合成的影響Fig.6 Effect of the precursor supply on lycopene production

這一產量與利用成團泛菌來源基因合成番茄紅素產量為13.23 mg/L還有一定差距，可能是過表達MVA途徑tHMG1、GGPS以及其他一些同工酶的編碼基因有關[15]。進一步分析工程菌W4、W5的中間代謝產物累積情況，發現工程菌W5較工程菌W4均有顯著提高(如圖7所示)。

為了驗證相關因素對番茄紅素途徑表達的影響在強化MVA途徑后是否相同，構建了使用單拷貝質粒pRS41H為表達載體的酵母工程菌W6，工程菌W6的番茄紅素產量也能達到1.32 mg/L(如圖6所示)，與W1、W2、W3和W4菌株相比，合成番茄紅素的產量都有不同程度的提高，而相比工程菌W5產量有所下降。說明強化MVA途徑后，基因拷貝數對途徑表達效果的影響相似，而通過強化MVA途徑，有效地平衡了釀酒酵母合成番茄紅素的前體物供給，強化了釀酒酵母類異戊二烯合成途徑的代謝通量，進而增加了釀酒酵母合成番茄紅素的能力。

圖7 工程菌W4和W5中間代謝產物角鯊烯(a)和法呢醇(b)的積累曲線Fig.7 The accumulation curves of intermediate metabolite of lycopene synthesized by Saccharomyces cerevisiae

3 結論

(1)不同遺傳背景的酵母菌株在番茄紅素的異源合成中有差異，相同培養條件下，釀酒酵母CEN.PK2-1C較釀酒酵母INVSc1更利于合成番茄紅素。

(2)表達載體在底盤細胞中的拷貝數直接影響外源模塊中的表達水平，對目標產物的產量有影響，在相同培養條件下，多拷貝表達質粒pRS42K較單拷貝表達質粒pRS41H更有利于合成番茄紅素。

(3)半乳糖誘導型啟動子和組成型啟動子都能調控番茄紅素途徑的表達，相同培養條件下，組成型啟動子較半乳糖誘導型啟動子更適合釀酒酵母中番茄紅素途徑的表達。

(4)強化MVA途徑有效地平衡了釀酒酵母合成番茄紅素的前體物供給，顯著提高了番茄紅素的合成。