脂肪預乳化對肌原纖維蛋白-脂肪復合體系凝膠性質的影響及機理

王悅，王亞娜，尚永彪,2,3*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715) 2(農業部農產品貯藏保鮮質量安全評估實驗室(重慶)，重慶，400715) 3(重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶，400715)

乳化型肉制品(肉糜類產品)是我國肉制品的重要組成部分，因品種豐富、口感細嫩、風味獨特備受廣大消費者的歡迎[1]。乳化肉糜通常由肌肉組織、脂肪組織、鹽、水等多種成分混合剪切而成，因此肉的乳化過程是發生在整個剪切斬拌過程中，肌肉組織中的一些鹽溶性肌原纖維蛋白被高濃度鹽溶液萃取出來，脂肪組織被斬拌成小的脂肪顆粒，兩者通過疏水作用等結合，從而使肉糜得以相對穩定的狀態存在。在肌肉蛋白與脂肪構成的復雜體系中，蛋白凝膠的形成非常重要，熱誘導的蛋白與蛋白之間相互交聯使肌原纖維蛋白由粘性溶膠過渡到三維網狀凝膠結構[2]，對持水性以及脂肪的穩定也有著很大的貢獻，反過來脂肪球也強化了蛋白質骨架結構，脂肪顆粒以填充物或共聚物的形式占據蛋白質凝膠基質的網絡空隙，從而減少了肉類產品的膠體孔隙度、影響產品的質量[3]。

預乳化脂肪的研究多以非肉蛋白(酪蛋白酸鈉[4]、乳清蛋白[5]、大豆分離蛋白[6])作為乳化劑預乳化脂肪，或以肌原纖維蛋白本身作為乳化劑，通過乳化形成脂肪球膜蛋白，再通過二硫鍵或其他力相互作用與連續相蛋白基質相連。賈麗娜[7]研究發現乳化油脂能提高羅非魚肌原纖維蛋白復合凝膠的持水力；XIONG等[8]研究表明用肌原纖維蛋白乳化豬油等油脂可以明顯提高雞肉肌原纖維蛋白的凝膠強度；李鋒等[9]將新型復合乳化劑配方應用于乳化香腸中提高了產品品質。但是，乳化劑和脂肪對肉制品凝膠影響機理的基礎研究還有待于擴展和深化。在乳化肉制品的生產中常使用的小分子乳化劑有單硬脂酸甘油酯(GMS)、蔗糖脂肪酸酯(SE)、大豆卵磷脂(LEC)等，它們可以使配料充分乳化、均勻混合，防止脂肪離析，提高產品的保水性，增加彈性、嫩度，減少粘連，使產品易于脫模和切片，提高肉制品的質量。

本文通過對乳化劑預乳化脂肪與肌原纖維蛋白形成復合乳狀液的乳化穩定性、表面張力、脂肪微粒吸附蛋白膜組分以及所形成復合乳化物凝膠的流變學性質、脫水收縮比例、質構特性等指標的測定分析，探討脂肪預乳化對肌原纖維蛋白-脂肪復合體系凝膠性質的影響及其機理，旨在為進一步研究乳化劑在肉糜類制品中的應用提供一定的參考依據，同時為開發新型肉糜制品提供技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瘦豬肉、豬背膘，重慶市北碚區天生街道菜市場；NaCl、三聚磷酸鈉、焦磷酸鈉、六偏磷酸鈉、KH2PO4、考馬斯亮藍R-250、過硫酸銨、甘油、β-巰基乙醇、四甲基乙二胺(TEMED)(分析純)，成都市科龍化工試劑廠；甲醇、冰醋酸(分析純)，寧波大川精細化工有限公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)(分析純)，Sigma-Alorich；十二烷基磺酸鈉(SDS)(分析純)，BIOSHARP；甘氨酸(分析純)，Vetec-Sigma。

1.2 儀器與設備

5810型臺式高速離心機，德國Eppendorf公司；XHF-D高速分散器，寧波新芝生物科技股份有限公司；4K-1SSIGMA冷凍離心機，德國SIGMA公司；TA.XT2i質構儀，英國Stab. Micro System公司；A101電泳儀，美國科諾工業有限公司；THZ-82恒溫振蕩器，常州智博瑞儀器制造有限公司；G:BOX凝膠成像系統，美國基因公司；HR-1流變儀，美國TA公司；A101表面張力儀，美國科諾工業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肪的預乳化

稱取一定量的乳化劑，加65 ℃熱水溶解，高速剪切混合均勻，制成1%的乳化劑，冷卻至30 ℃，與絞肉機斬拌2 min的肥肉混合攪拌均勻所得到的乳化脂在4 ℃條件下靜置1～2 h。

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取

參考XIONG等[10]的方法并稍作調整，首先將半解凍狀態下的瘦肉用絞肉機絞碎，稱取一定量的碎肉加入4倍體積的分離緩沖液(0.1 mol/L NaCl，10 mmol/L Na3PO4，MgC12，1 mmol/L EGTA，pH 7.0)，在0～4 ℃的條件下，10 000 r/min高速勻漿60 s，然后將勻漿液在4 ℃、8 000 r/min的條件下離心15 min，棄去上清液，取沉淀，重復上述離心步驟3次，用分離緩沖液沖洗2次，得到粗肌原纖維蛋白質。然后將沉淀與4倍體積0.1 mol/L NaCl的溶液混合，10 000 r/min高速勻漿60 s，依照第一次離心條件再次離心，重復2次，得到的肌原纖維蛋白4 ℃下冷藏保存，在48 h內使用。提取的肌原纖維蛋白濃度用雙縮脲法進行測定，標準蛋白為結晶牛血清蛋白。

1.3.3 肌原纖維蛋白-脂肪復合物的制備

為探明乳化劑對脂肪與肌原纖維蛋白復合體系乳化凝膠性質的影響，選擇3種乳化劑與脂肪、肌原纖維蛋白按照以下方式形成5組不同的復合體系(復合乳化液和復合凝膠),如表1所示。將含有300 g/L預乳化脂肪和10 g/L肌原纖維蛋白的溶液用高速勻漿機進行混合均質，制備成復合乳化液(乳化液應現用現制，放置會影響相應指標的測定)；取一定量的預乳化脂肪與肌原纖維蛋白復合乳化物于10 mL的塑料離心管中，置于水浴鍋中，以1 ℃/min的升溫速度從20 ℃升至70 ℃，并保持20 min，將試樣從水浴鍋中取出，快速冷卻至4 ℃，并在4 ℃的條件下放置24 h，制備成的復合凝膠含有100 g/L的肌原纖維蛋白和100 g/L的預乳化脂肪[11]。

表1 肌原纖維蛋白-脂肪復合物的制備Table 1 Fat and myofibrillar protein composite emulsion

1.3.4 肌原纖維蛋白-脂肪復合乳化液乳化穩定性的測定

復合乳化液的乳化穩定性采用濁度法測定[12]。取50 mL塑料離心管，向其中加入25 mL 1 g/L的SDS溶液，然后從新鮮制得的乳化液底部取得50 μL乳化液加入離心管中，用1 g/L SDS溶液對分光光度計進行調零，測新鮮制得的乳化液在500 nm處的吸光度值記為A0。將上述新鮮制得的乳化液放在25 mL的小燒杯中，在4 ℃條件下靜置10 、30 、60 和120 min時間間隔后，用相同的方法測乳化液在500 nm處的吸光度值記為At，通過公式(1)計算復合乳化液隨時間變化的乳化穩定性(emulsifying stability index，ESI)，即：

(1)

1.3.5 肌原纖維蛋白-脂肪復合乳化液表面張力的測定

復合乳化液的表面張力值在室溫下(25 ℃)，用表面張力儀進行測定。

1.3.6 肌原纖維蛋白-脂肪復合乳化液中脂肪微粒表面吸附蛋白組分分析

復合乳化液攪拌后，在5 000 r/min條件下離心15 min，取乳化脂肪層，加Trix緩沖液(含有1% SDS)，-20 ℃下凍存12 h，4 ℃下解凍，再放在-20 ℃下凍存12 h，4 ℃下解凍，如此重復操作3次，將復合體系中吸附在脂肪微粒表面的蛋白分離出來，采用SDS-PAGE電泳系統分析蛋白組成成分。分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%，電泳開始時先采用恒定電流15 mA，待樣品進入分離膠后將電流調節至25 mA。

1.3.7 肌原纖維蛋白-脂肪復合乳化物流變學性質的測定

肌原纖維蛋白-脂肪復合乳化物在熱誘導凝膠過程中的黏彈性特點由實驗室流變儀測定。取適量肌原纖維蛋白-脂肪復合乳化物置于樣品臺上，涂布均勻，盡量地趕掉氣泡，采用40 mm的夾具測試。測定參數為：狹縫0.5 mm，頻率1 Hz，應變0.002 5，樣品以2 ℃/min的速度從20 ℃升溫至85 ℃，在85 ℃保持1 min，然后以5 ℃/min的速度從85 ℃降溫至5 ℃，記錄復合乳化物的儲存模量(G′)隨溫度升高的變化情況。

1.3.8 肌原纖維蛋白-脂肪復合凝膠脫水收縮比例的測定

復合凝膠的脫水收縮測定采用排水法。首先將離心管中的上清液倒掉，然后將塑料離心管倒置控出所有液體，損失的液體質量與原凝膠質量的比值表示凝膠的脫水收縮程度。

1.3.9 肌原纖維蛋白-脂肪復合凝膠質構的測定

測定前將煮好的凝膠試樣從4 ℃冰箱中取出，在室溫下放置1 h，擦凈凝膠表面水分，切成10 mm高的凝膠小段，利用質構儀的Texture Profile Analysis(TPA)模塊測定復合凝膠的質構特性。質構儀的設置參數如下[13]：探頭類型：P5；測前速度：1 mm/s；測中速度：0.5 mm/s；測后速度：1 mm/s；壓縮比：50%；觸發類型：auto；觸發力：5 g；停留時間：5 s。

1.3.10 肌原纖維蛋白-脂肪復合凝膠保水性的測定

復合凝膠的保水性可以定義為離心后凝膠沉淀的重量與離心前原始凝膠的重量之比。參照KOCHER[14]的離心法測定復合凝膠保水性，測定前先將復合凝膠試樣從4 ℃條件下取出，在室溫下放置1 h，稱重m，放置在離心管中，在4 ℃、5 000 r/min下離心15 min，去除試管中離心出的水，將離心管倒置于濾紙上方，將凝膠取出后，稱重m1。

保水性的計算公式如下：

(2)

1.4 數據統計與分析

所有實驗數據均為至少重復3次后的平均值，數據采用SPSS Statistics 17.0統計軟件進行顯著性分析和方差分析，方差分析采用ANOVA分析，數據進行正態分布檢驗，差異顯著性為p<0.05。實驗結果用Origin 8.1作圖表示。

2 結果與分析

2.1 預乳化處理對肌原纖維蛋白-脂肪復合體系乳化穩定性的影響

乳化劑對脂肪預乳化后加入到肌原纖維蛋白中所制得的復合乳化液的乳化穩定性的變化如表2所示。

時代的大變遷，給教育帶來了很大的變化，特別是信息技術的大發展，促進了新的教學方法和手段不斷涌現，如微課、慕課及翻轉課堂，如何將這些新的教學方法和手段運用到課程教學中并發揮更大作用值得思考和嘗試。

表2 肌原纖維蛋白-脂肪復合乳化液的乳化穩定性Table 2 ESI of fat and myofibrillar protein composite emulsion

注：所有數據表示為平均值±標準差，n=3;同一列數據上角標不同小寫字母a～d表示差異顯著(p<0.05);同一行數據上角標不同大寫字母A～D表示差異顯著((p<0.05)。

乳化穩定性指數ESI為乳化液在放置一定時間后，在500 nm處的吸光值與新鮮制備的乳化液在500 nm處的吸光值的比值，比值越接近1，說明乳化液的變化越小；隨放置時間的延長ESI值的變化差值越小，說明乳化液的穩定性也越好[15]。

由表2結果可以看出，各處理組從放置10 min到120 min之間ESI值顯著降低(p<0.05)，表明各組乳化液的穩定性隨時間延長變差；在同一時間段內，各實驗組ESI值顯著均高于對照組(A組)(p<0.05)，表明乳化劑提高了肌原纖維蛋白-脂肪復合體系的乳化穩定性。E組(脂肪+大豆卵磷脂+肌原纖維蛋白)的ESI值高于對照組但低于預乳化處理組，這與E組中乳化劑在復合體系中的溶解度有關，預乳化脂肪組采用熱水溶解乳化劑能夠使乳化劑充分發揮了乳化作用，可以使脂肪更好地分散在復合乳化液中，提高乳化體系的穩定性。D組(大豆卵磷脂預乳化脂肪+肌原纖維蛋白)的ESI值高于其他預乳化處理組，與其他處理組間差異顯著(p<0.05)，且D組乳化液放置10～120 min，ESI值的變化差值最小，從0.965變為0.841，變化差值為0.124，而對照組在此期間ESI值從0.887變為0.635，變化差值為0.252。放置10～60 min，同一時間段內，B組(單硬脂酸甘油酯預乳化脂肪+肌原纖維蛋白)與C組(蔗糖脂肪酸酯預乳化脂肪+肌原纖維蛋白)ESI值差異不顯著(p>0.05)，B組ESI值的變化差值高于C組。綜上可得，D組乳化液的穩定性最好，然后依次為C組、B組、E組、A組。

2.2 預乳化處理對肌原纖維蛋白-脂肪復合體系表面張力的影響

由于乳化液中水油界面上存在著很高的界面能，因此乳化液體系很不穩定，極易破乳分層，降低乳化液的表面張力，可使乳化液穩定性增強[16]。肌原纖維蛋白-脂肪復合乳化液的表面張力值如圖1所示。由圖1可知，C組(蔗糖脂肪酸酯)和D組、E組(大豆卵磷脂)顯著降低了復合乳化液表面張力(p<0.05)，C組相比對照組表面張力值從25.03 mN/m 下降到了17.83 mN/m，D組、E組表面張力值分別為19.42 mN/m、21.88 mN/m，B組(單甘油脂肪酸酯)與對照組復合乳化液的表面張力值無顯著差異(p>0.05)，B組表面張力值為25.35 mN/m。

圖1 肌原纖維蛋白-脂肪復合乳化液的表面張力Fig.1 Surface tension of fat and myofibrillar protein composite emulsion

2.3 肌原纖維蛋白-脂肪復合體系中脂肪微粒表面吸附蛋白組分分析

各處理組肌原纖維蛋白-脂肪復合體系中脂肪微粒表面吸附蛋白膜組分分析見圖2。

圖2 肌原纖維蛋白-脂肪復合乳化液脂肪微粒吸附蛋白SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE of protein composition of fat particle membrane in fat and myofibrillar protein composite emulsion

根據電泳條帶數量與條帶顏色深淺可得，各實驗組肌原纖維蛋白-脂肪復合體系中脂肪微粒表面吸附蛋白量與蛋白種類相比對照組(A組)都有所增加，但蛋白膜的主要組成成分相同，通過與標準蛋白分子量對照可得，各組樣品中脂肪微粒表面蛋白膜的成分主要為肌球蛋白重鏈(200 kDa)、肌動蛋白(41～61 kDa)、原肌球蛋白(34～36 kDa)和肌鈣蛋白(30～37 kDa)，與對照組相比實驗組肌原纖維蛋白-脂肪復合體系的電泳條帶中多了分子質量較低的肌球蛋白輕鏈(23.5 kDa)。

2.4 預乳化處理對肌原纖維蛋白-脂肪復合體系動力學流變性質的影響

各處理組肌原纖維蛋白-脂肪復合凝膠的流變學特性與復合凝膠結構密切相關，貯能模量值G′值高意味著凝膠能力強，是代表彈性行為的一個示例。由圖3可知，各處理組肌原纖維蛋白-脂肪復合凝膠的G′值隨溫度增加的變化趨勢基本一致，20～42 ℃時保持平穩，42 ℃開始緩慢增加，在46 ℃附近達到一個小的峰值后出現略微下降，之后又急速上升，在72 ℃時達到平臺區，之后保持穩定。這種流變學的轉變在肌原纖維蛋白和肌球蛋白加熱凝膠的過程中可以廣泛地觀察到，肌原纖維蛋白特別是肌球蛋白的結構性變化與相互作用可以對上述現象作出解釋。

圖3 肌原纖維蛋白-脂肪復合凝膠加熱過程中儲能模量的變化Fig.3 Changes of storage modulus in fat and myofibrillar protein composite emulsion during cooking

加熱過程中，在同一溫度下，對照組(A組)凝膠的G′值均低于實驗組，在85 ℃凝膠最終形成時，3種乳化劑預乳化脂肪與肌原纖維蛋白復合凝膠(B組、C組、D組)的G′值分別為7 419.93、8 811.33和7 920.50 Pa，E組(在復合凝膠中添加乳化劑)的G′值為6 698.51 Pa，而對照組(A組)的G′值則為5 321.20 Pa，表明乳化劑的添加能夠使復合凝膠的凝膠能力增強，彈性值增加，且采用預乳化方式加入乳化劑的凝膠顯示出更好的凝膠能力。分析原因是脂肪顆粒添加到肌原纖維蛋白凝膠溶液中可以作為“填料”填充在凝膠網絡的空隙處，在凝膠形成過程中彈性模量得到了顯著的增加，而預乳化的脂肪更容易進入凝膠網絡的構建，對復合凝膠性能改善更為明顯。當復合乳化液采用同種方法制備時，由于乳化顆粒大小不同，以及乳化劑層與凝膠網絡蛋白之間的相互作用強度差異，不同乳化劑制得的復合凝膠的強度也不同。對于同一種乳化劑，預乳化脂肪制得的復合凝膠的凝膠強度一般要大于直接添加乳化劑制得的復合凝膠，說明通過直接添加的方式乳化劑未能充分乳化脂肪，形成的凝膠網絡不夠穩定導致復合凝膠彈性下降。XIONG等[17]提出乳化劑的類型會影響脂肪球大小的變化。吳滿剛[18]的研究結果顯示，在肉蛋白凝膠中脂肪的數目越多、顆粒越小，填充到凝膠網絡中對結構的支撐作用越明顯。

2.5 預乳化處理對肌原纖維蛋白-脂肪復合體系脫水收縮比例的影響

圖4 肌原纖維蛋白-脂肪復合凝膠脫水收縮比例Fig.4 Syneresis ratio of fat and myofibrillar protein composite gels

由圖4可知，對照組A組(脂肪+肌原纖維蛋白)在凝膠形成過程中脫水收縮比例為7.03%，B組(單硬脂酸甘油酯預乳化脂肪+肌原纖維蛋白)和C組(蔗糖脂肪酸酯預乳化脂肪+肌原纖維蛋白)在凝膠形成過程中脫水收縮比例相比對照組降低，分別為6.33%和6.92%，但與對照組差異不顯著(p>0.05)。含有大豆卵磷脂的復合凝膠體系(D組和E組)的脫水收縮比例相比對照組顯著降低(p<0.05)，分別為5.90%和6.29%。綜上可得，含有大豆卵磷脂的凝膠復合體系在形成凝膠過程中脫水收縮比例下降顯著，其次為單硬脂酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯，且大豆卵磷脂預乳化脂肪與肌原纖維蛋白復合體系在形成凝膠過程中脫水收縮比例最低。

2.6 預乳化處理對肌原纖維蛋白-脂肪復合體系質構的影響

凝膠是由蛋白質分子受熱變性展開，按照一定順序相互聚合而形成一個連續的網絡結構。為了進一步闡明乳化后的脂肪顆粒在肌原纖維蛋白凝膠特性中的作用，測定了不同乳化劑和添加方式對復合凝膠質構的影響，如表3所示，3種乳化劑預乳化脂肪與肌原纖維蛋白形成的復合凝膠(B、C、D組)的硬度值高于添加乳化劑的復合凝膠(E組)高于對照組復合凝膠(A組)，且三者之間差異顯著(p<0.05)，3種乳化劑預乳化脂肪與肌原纖維蛋白形成的復合凝膠從高到低依次為蔗糖脂肪酸酯(C組)>單硬脂酸甘油酯(B組)>大豆卵磷脂(D組)；3種乳化劑預乳化脂肪與肌原纖維蛋白形成的復合凝膠的彈性值低于添加乳化劑的復合凝膠但差異不顯著(p>0.05)，高于對照組復合凝膠差異顯著(p<0.05)；3種乳化劑預乳化脂肪與肌原纖維蛋白形成的復合凝膠和添加乳化劑的復合凝膠的黏聚性、膠著性、咀嚼性均顯著高于對照組復合凝膠(p<0.05)；各處理組復合凝膠的回復性差異不顯著(p>0.05)。

表3 肌原纖維蛋白-脂肪復合凝膠質構特性Table 3 Texture of fat and myofibrillar protein composite gels

2.7 預乳化處理對肌原纖維蛋白-脂肪復合體系保水性的影響

不同處理組肌原纖維蛋白-脂肪復合凝膠的保水性如圖5所示，由圖5可知大豆卵磷脂預乳化脂肪與肌原纖維蛋白復合凝膠(D組)的保水性最好，為86.73%，其次為添加大豆卵磷脂的肌原纖維蛋白-脂肪復合凝膠(E組)為85.08%，兩者之間差異不顯著(p>0.05)，單硬脂酸甘油酯和蔗糖脂肪酸酯預乳化脂肪與肌原纖維蛋白復合凝膠(B組和C組)的保水性分別為84.41%和83.24%，相比對照組(脂肪與肌原纖維蛋白復合凝膠)的保水性82.78%有所升高，但差異不顯著(p>0.05)。

圖5 肌原纖維-脂肪蛋白復合凝膠保水性Fig.5 Water-holding capacity of fat and myofibrillar protein composite gels

肌原纖維蛋白熱誘導凝膠是蛋白質之間相互作用形成空間三維網絡結構的過程。在受熱過程中，肌原纖維蛋白中的肌球蛋白和肌動蛋白相互作用，纏繞重組，形成較為均一的網絡結構，這些網絡結構較穩定時會將游離水封閉在其中，使得凝膠保水性增強[19]。

3 結論

本文通過對乳化劑預乳化脂肪與肌原纖維蛋白形成復合乳狀液的乳化穩定性、表面張力、脂肪微粒吸附蛋白膜組分以及所形成復合乳化物凝膠的流變學性質、脫水收縮比例、質構特性等指標的測定，探討脂肪預乳化對肌原纖維蛋白-脂肪復合體系凝膠性質的影響及其機理。

3種乳化劑預乳化脂肪添加到肌原纖維蛋白中構成復合體系與對照組(脂肪+肌原纖維蛋白)相比，乳化液的乳化穩定性增強，D組(LEC)乳化液乳化穩定性最好，其次為C組(SE)、B組(GMS)；D組(LEC)和C組(SE)表面張力值顯著降低；脂肪微粒吸附蛋白量增加；凝膠加熱過程中G′值升高，表明脂肪預乳化可以顯著提高復合體系凝膠能力，并且凝膠強度受乳化脂肪顆粒大小影響；脫水收縮比降低，D組(LEC)脫水收縮比例最低，其次為B組(GMS)、C組(SE)；復合體系凝膠保水性提高，D組(LEC)保水性最好，為86.73%；復合體系凝膠硬度值、彈性、黏聚性、咀嚼性等質構特性顯著升高；添加乳化劑的E組在上述性質中表現出低于乳化劑預乳化脂肪組而高于對照組，說明該添加方式未能充分乳化脂肪導致復合體系不夠穩定。因此，脂肪的預乳化能夠顯著提高肌原纖維蛋白-脂肪復合體系的乳化效果及凝膠性能。