熱風干燥工藝對貯存期大曲揮發性物質的影響

夏玙，羅惠波,2*，周平，黃丹，鄧波，沈才萍，鄔捷峰，田學梅

1(四川理工學院 生物工程學院，四川 自貢,643000)2(釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川 自貢,643000) 3(勁牌有限公司，湖北 大冶, 435100) 4(瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州, 646000) 5(國家固態釀造工程技術研究中心，四川 瀘州, 646000)

大曲在大曲酒釀造過程中起著重要的作用。大曲集酶系、菌系和物系于一身，不僅是糖化發酵劑，也是釀造原料的一部分[1]。其所含的大量風味物質或前體物質在釀造過程中直接或間接地進入酒體，對中國白酒的香型和風格有著深遠的影響[2]。由于制曲所用的工藝、曲房的控制水平和條件等千差萬別，最終導致大曲的香氣成分也各不相同[3]。

頂空固相微萃取-氣質聯用(headspace solid-phase microextraction coupled to gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)技術能夠吸附并濃縮樣品中的目標物質，分析復雜體系中揮發性組分的特征，具有高效便捷、安全無溶劑、靈敏度高等優點，近年來已被廣泛應用于大曲風味物質的研究中[4-5]。并有大量關于利用SPME分析大曲風味成分的報道[6-8]。

大曲在培菌的過程中常常會遭受曲蟲的侵害，它們在大曲上取食、產卵、繁殖，給大曲的質量造成了嚴重的危害[9-10]。本課題組通過一系列的研究，利用熱處理殺蟲技術建立了一種綠色環保的治理曲蟲和大曲人工干燥的方法，建立了外源加熱的大曲熱風干燥工藝，在有助排濕的同時，又能有效地殺滅曲蟲。而大曲在生產應用中往往要經過3～6個月的貯存成為陳曲，為了探究外源熱風干燥對大曲在貯存期帶來的相關影響，本研究采用HS-SPME-GC-MS技術，對排潮降溫期大曲進行熱風、自然干燥處理，對比實驗室貯存、曲庫貯存以及自然干燥后曲庫貯存的大曲在揮發性風味物質之間的差異，以期為進一步優化大曲干燥工藝提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

濃香型大曲，采集于中國四川省瀘州市懷玉制曲生態園；乙酸丁酯(色譜純)，天津光復精細化工研究所。

1.2 儀器與設備

84Y-3型風速可控干燥箱，和成儀器儀表(昆山)有限公司；HT300A自動固相微萃取儀，意大利HTA公司；Agligent 7890A-5975B型氣相色譜-質譜聯用儀，美國安捷倫公司；50/30 μm DVB/CAR on PDMS萃取頭，上海安譜實驗科技股份有限公司；15 mL帶硅橡膠墊的樣品瓶，美國 Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

取培菌第8天排潮降溫期的大曲，用84Y-3型風速可控干燥箱進行最佳熱風干燥處理，同時與同一曲庫、同一存放地點的自然干燥大曲進行對比。將進行熱風干燥處理后的大曲分成2批: 一批大曲在熱風干燥處理后直接在實驗室條件下貯存，另一批放回曲庫中繼續貯存。研究不同干燥方式和貯存方式的大曲在干燥前后、貯存1個月、貯存2個月之間的差異。曲樣干燥和貯存處理流程如圖1所示。

圖1 大曲干燥和貯存處理流程圖Fig.1 The flow chart of Daqu sample with different drying and storage processes

將干燥前的大曲批次(原曲)標記為RG1，熱風干燥處理后的大曲批次標記為FK1，在曲庫進行自然干燥的大曲批次(與熱風干燥同時間的大曲)標記為ZR1；將熱風干燥處理的大曲FK1直接在實驗室條件下貯存1個月、2個月后的大曲批次分別標記為RG2、RG3，將熱風干燥處理的大曲FK1在曲庫貯存1個月、2個月后的大曲批次分別標記為FK2、FK3；將大曲ZR1直接在曲庫貯存1個月、2個月后的大曲批次分別標記為ZR2、ZR3。每個處理方式的大曲選取3塊曲構成3個平行樣，粉碎后混合成一個樣本，曲樣均置于-20 ℃保藏備用。

大曲最佳熱風干燥工藝為：第一階段溫度為47.81 ℃，風速為1.28 m/s，水分含量轉換點15.49%。第二階段溫度為45.01 ℃，風速為0.32 m/s。

1.3.2 大曲揮發性風味物質檢測方法

使用HS-SPME-GC-MS檢測大曲中揮發性風味物質的含量。準確稱取粉碎大曲樣品2 g，直接裝入5 mL頂空樣品瓶中，加入質量濃度為0.2 g/L的乙酸丁酯內標50 μL。SPME條件：溫度70 ℃，平衡時間15 min，萃取時間50 min。GC-MS進樣口解吸4 min，GC-MS分析條件設定按照參考文獻[11]。

數據分析：通過對比檢出揮發性物質的質譜圖與標準譜庫(NIST05a.L)，匹配度和純度大于 800作為鑒定結果。以乙酸丁酯為內標，按峰面積歸一化法算出樣品中各個組分的相對含量。

1.3.3 主成分分析

主成分分析采用 SPSS Statistics 20.0軟件。

2 結果與討論

2.1 大曲中揮發性物質成分分析

采用HS-SPME-GC-MS技術分析大曲揮發性物質成分，不同處理方式大曲揮發性物質結果如表1所示。

表1 不同處理方式大曲的揮發性成分及其相對含量Table 1 Volatile compounds and relative contents in Daqu with different treatment methods

續表1

類別序號化合物名稱3種不同處理方式的大曲揮發性風味成分/(μg·g-1)RG1FK1ZR1RG2FK2ZR2RG3FK3ZR3酯類13壬酸乙酯—2.32—1.100.741.14—0.670.1114癸酸乙酯0.590.400.450.430.490.560.430.460.3615月桂酸乙酯0.691.060.791.041.911.600.901.041.0916十四酸乙酯5.094.444.384.985.246.393.384.594.4117十五酸乙酯2.982.462.452.683.184.052.032.863.0318棕櫚酸乙酯66.5168.7454.8459.9456.4066.7337.8848.2143.28199-十六碳烯酸乙酯2.373.351.793.064.483.391.812.302.5420甘油三丁酸酯———0.64—0.25———21十七酸乙酯0.480.490.390.410.300.300.140.280.1922反油酸乙酯0.200.39——0.110.31—0.14—23硬脂酸乙酯0.711.080.741.080.701.150.610.810.5224油酸乙酯17.6726.8818.3821.2417.2824.0612.5316.8513.4525亞油酸乙酯25.4240.1925.6228.9224.5735.0214.9023.4217.9526亞麻酸乙酯0.560.990.500.910.930.94—0.660.38∑131.13159.39124.01130.35120.29151.2979.82113.2793.89芳香類27苯甲醛8.459.429.322.221.421.731.701.150.8028苯甲醇2.183.271.710.911.120.860.600.750.2329苯乙醇10.7616.0014.684.708.787.573.067.595.1130苯乙醛0.710.600.81——0.43———31苯乙烯———1.21——1.320.20—32鄰苯二甲酸二丁酯—0.660.28——————33二叔丁基苯酚———0.140.130.20———34苯乙酸乙酯——0.29——0.16———∑22.1029.9627.099.1811.4510.946.689.696.15吡嗪類352,6-二甲基吡嗪0.220.950.680.700.490.240.650.410.43362,3,5-三甲基吡嗪0.631.010.740.670.940.660.720.780.59372,3,5,6-四甲基吡嗪0.530.951.120.612.471.640.801.861.66∑1.382.902.531.973.902.542.173.042.68烷烯類38十二烷0.590.070.760.190.961.110.240.440.7739十四烷1.520.921.690.120.320.22——0.35405-十一炔——0.19———0.180.20—416-十二炔————0.29——0.230.26428-十六炔—0.26—0.320.54—0.14——43二十烷0.72————————441-石竹烯2.110.711.971.29—0.831.841.870.3645α-石竹烯0.14—0.510.21—0.14———46α-長葉蒎烯0.14—0.22———0.13——47順-8,11,14-二十碳三烯酸0.180.360.19————0.21—48環烷0.680.700.700.500.22————∑6.093.016.232.632.342.302.512.941.74醛酮類492-丁烯醛1.90—0.39——————50糠醛0.681.590.870.150.12————51苯基巴豆醛0.810.400.89——0.52——0.17526,10,14-三甲基-2-十五烷酮0.240.190.15——————∑3.642.182.310.150.120.520.000.000.17雜環類532-正戊基呋喃1.661.601.010.870.610.190.620.31—543-甲基吡啶0.57————————∑2.231.601.010.870.610.190.620.31—

注：— 表示未檢測到物質。

9種不同處理方式大曲的揮發性物質經計算機譜庫，共檢測出54種揮發性風味物質，主要分為7大類，其中醇類7種、酯類19種、芳香類8種、吡嗪類3種、烷烯類11種、醛酮類4種何雜環類2種。由圖2看，酯類化合物含量最高，其次是芳香類化合物。從大曲RG1、FK1、ZR1中檢測出的揮發性風味成分種類分別為43、41、42種，從RG2、FK2、ZR2中檢測出的揮發性風味成分種類分別為37、36、35種，RG3、FK3、ZR3中檢測出的揮發性風味成分種類分別為31、34、29種。無論是熱風干燥還是自然排潮降溫干燥工藝，大曲的揮發性風味成分的種類無明顯變化，但均在貯存期有減少的趨勢。

圖2 不同處理的大曲各類揮發性物質的含量變化Fig.2 Changes of the content of various volatile compounds in Daqu with different processes

2.2 熱風干燥工藝對貯存期大曲各類化合物的影響

醇類是構成白酒呈味類物質成分之一，是酒中醇甜物質的重要來源，也是酯類物質的前體物質[12-13]。從表1可以看出，大曲FK1的醇類化合物總量比RG1高40.11%，而ZR1的醇類化合物總量比RG1低15.63%，說明在大曲自然干燥的過程中，醇類化合物呈降低的趨勢，而熱風干燥增加了醇類物質的含量。特別是2,3-丁二醇的含量明顯增多，可能由于熱風干燥會刺激2,3-丁二醇的大量生成。2,3-丁二醇有甜味，可以改善白酒的風味，同時可增香[14]。大曲在貯存1、2個月時，RG2、FK2的醇類化合物總量高于ZR2，RG3、FK3的醇類化合物總量高于ZR3，說明大曲經過熱風干燥后不管是在實驗室貯存還是返回曲庫貯存都比大曲自然干燥貯存生成的醇類化合物更多，這可能是由于熱風干燥的過程給微生物提供了一個更好的代謝環境，致使這些微生物在貯存期依然可以加快醇類化合物的代謝。

大曲酯類化合物是大曲中含量最高的化合物，其產生途徑包括有機化學產生和微生物代謝產生。從表1中可以看出，FK1的酯類化合物總量比RG1高21.55%，而ZR1的酯類化合物總量比RG1低5.43%，說明大曲熱風干燥能夠促進大曲酯類化合物的形成，對長鏈酯類化合物如硬脂酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯等的形成有很大的促進作用，可能是由于溫度處理能夠加快酯化反應的進程。大曲在貯存1個月時，RG2、FK2的酯類化合物總量均低于ZR2；在貯存2個月時，FK3的酯類化合物總量又高于ZR3，ZR3的酯類化合物高于RG3，可能是大曲自然干燥貯存曲酯類物質的呈現在貯存1個月左右最好，后期熱風干燥返庫曲酯類物質呈現較好，而實驗室貯存條件不利于酯類物質的生成。3種大曲在貯存期總酯含量均有所下降，與相關報道吻合[15-16]。

芳香族化合物對大曲風味有重要貢獻，從表1可以看出，FK1、ZR1的芳香族化合物總量分別比RG1高35.57%、22.58%，說明大曲在干燥過程中芳香族化合物含量有升高的趨勢，而熱風干燥更能促進芳香族化合物的產生；大曲在貯存1個月時，FK2的芳香族化合物總量高于RG2、ZR2，貯存2個月時，FK3的芳香族化合物總量高于RG3、ZR3，而RG2與ZR2之間、RG3與ZR3之間芳香族化合物含量差異不大，說明大曲熱風干燥曲庫貯存更加有利于芳香族化合物的形成。

從大曲吡嗪類化合物的變化情況來看，FK1、ZR1的吡嗪類化合物總量分別比RG1高2.10倍、1.88倍，說明伴隨著大曲干燥過程的進行，吡嗪類化合物含量逐漸上升，而熱風干燥工藝更加有利于吡嗪化合物的形成；大曲在貯存期1、2個月，3種處理方式大曲的吡嗪類化合物含量比較均是FK2>ZR2>RG2和FK3>ZR3>RG3，且均比排潮降溫期高，說明熱風干燥促進吡嗪類化合物的生成作用可以持續到大曲貯存時期，此外還可能由于一些產吡嗪類化合物的微生物代謝作用。據研究，吡嗪的形成與美拉德反應和耐熱芽孢桿菌等微生物代謝有關[17]，而外源恒溫熱風干燥所帶來的促進性影響主要與美拉德反應有關還是與微生物代謝有關，有待進一步研究討論[18]。

由表1可以看出，在大曲干燥后烷烯類化合物含量是ZR1>RG1>FK1，且FK1比ZR1減少了51.69%，說明大曲自然干燥的過程烷烯類化合物有一定升高，但幅度較小，而熱風干燥的過程使其損失非常嚴重，這可能是因為熱風溫度加速了烷烯類化合物的散失；大曲在貯存1、2個月時，RG2、FK2、ZR2的烷烯類化合物差異較小，RG3和FK3的烷烯類化合物含量較ZR3多，說明熱風干燥不影響大曲貯存期烷烯類化合物的形成。

從醛酮類化合物的變化情況來看，FK1、ZR1的醛酮類化合物含量比RG1分別低40.11%和36.54%，說明大曲干燥的過程是醛酮類化合物逐漸減少的過程；大曲在貯存1個月時，RG2和FK2的醛酮類含量要比ZR2低很多，而且貯存2個月后，RG3和FK3已經檢測不到醛酮類化合物的存在。對于大曲雜環類化合物，FK1的雜環類化合物含量要比ZR1高，說明熱風干燥有利于雜環類化合物的形成；大曲在貯存1、2個月時，RG2、FK2比ZR2高，RG3、FK3比ZR3高，說明熱風干燥對貯存期大曲雜環類化合物的形成還存在促進作用。

2.3 不同處理大曲中揮發性物質的主成分分析

利用SPSS 20軟件對不同處理的大曲曲樣中54種揮發性物質的含量數據進行主成分分析(principal component analysis，PCA)，得到主成分的特征值、貢獻率及載荷矩陣，見表2和表3。5個主成分累計貢獻率達到89.840%，可以較客觀地反映各曲樣中的揮發性風味物質的原始信息。

表2 5個主成分的特征值及其貢獻率Table 2 Eigenvalues, contribution and cumulative contribution of 5 principal components

表3 主成分載荷矩陣Table 3 Principal components loading matrix

續表3

序號化合物名稱主成分1主成分2主成分3主成分4主成分5526,10,14-三甲基-2-十五烷酮0.9820.083-0.062-0.0070.088532-正戊基呋喃0.9000.167-0.136-0.305-0.029543-甲基吡啶0.745-0.1930.564-0.105-0.227

從表3可以看出，第1主成分和糠醇、異戊醇、6,10,14-三甲基-2-十五烷酮、苯甲醛、2-正戊基呋喃、戊酸乙酯呈高度正相關，與月桂酸乙酯、2,3,5,6-四甲基吡嗪、二叔丁基苯酚、庚酸乙酯負相關。第2主成分與硬脂酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯、壬酸乙酯、亞麻酸乙酯、反油酸乙酯正相關，指向長鏈酯類物質。

以大曲樣品的第1主成分值為橫坐標，第2主成分值為縱坐標繪制散點圖，見圖3。根據距離的遠近9種樣品可分為6個區，RG1、FK1、ZR1、ZR2距離分散，各自成一區；RG3和ZR3距離接近，劃分為一區，命名為5區；RG2、FK2和FK3可劃為一區，命名為6區。結合干燥和貯存工藝分析，大曲經不同的干燥工藝(熱風干燥和自然干燥)后揮發性風味成分總體上有較大差異；大曲RG3、ZR3的落點接近，說明經熱風干燥后實驗貯存2個月大曲的揮發性風味與自然干燥貯存曲相接近。

圖3 大曲樣品的主成分散點圖Fig.3 PCA biplot for the Daqu samples

以54個揮發性物質成分的第1主成分值為橫坐標，第2主成分值為縱坐標繪制散點圖(累計主成分貢獻率為55.945%)。結合圖3和圖4可知，熱風干燥工藝影響大曲FK1的揮發性物質集中在第一象限，主要是硬脂酸乙酯(23)、油酸乙酯(24)、亞油酸乙酯(25)、亞麻酸乙酯(26)、反油酸乙酯(22)、棕櫚酸乙酯(18)，指向長鏈酯類物質。影響大曲ZR3、RG3的揮發性成分主要集中在第2主成分的負半軸，主要是正丁醇(1)、α-長葉蒎烯(46)、5-十一炔(40)、6-十二炔(41)、1-辛烯-3-醇(5)、1-石竹烯(44)、2-丁烯醛(49)，指向醇類和烷烯類。

圖4 大曲揮發性物質主成分散點圖Fig.4 PCA biplot for 54 volatile components

3 結論

大曲中有種類繁多的風味化合物，主要包括醇類、酯類、芳香族、醛酮類、吡嗪類等，這些物質在量上達到一定的平衡，構成了大曲的風味體系，從而對其產品風格的形成有著重要影響。在釀酒大曲生產工藝中，為適當降低發酵溫度，排除部分水分，控制微生物生長速度，翻曲是必不可少的一道工藝，通常降溫排潮主要是通過人工放門開窗來實現[19]。本研究改變了傳統的方式，提出外源熱風干燥工藝，對排潮降溫期的大曲進行兩階段溫度和風速的控制，在此前研究中已經得到該工藝下大曲在能耗、理化、風味、微生物等綜合指標上的最佳工藝。

對不同處理后大曲中的揮發性物質進行測定，以探究外源熱風干燥對大曲在貯存期的相關影響。結果表明，從9種大曲樣品中共鑒定出香味物質54種，包含醇類7種、酯類19種、芳香類8種、吡嗪類3種、烷烯類11種、醛酮類4種和雜環類2種。對9種大曲在揮發性風味化合物指標上的差異進行比較，結果表明外源熱風干燥工藝有利于貯存期大曲中醇類和酯類物質的增加，且熱風干燥返庫曲在芳香類和吡嗪類化合物上比自然干燥貯存曲更占優勢。對54種揮發性物質成分進行主成分分析，共提取5個主成分代表了89.840%以上的原始信息。大曲經不同的干燥工藝(熱風干燥和自然干燥)后揮發性風味成分總體上有較大差異，但熱風干燥實驗貯存曲與自然干燥貯存曲相接近；熱風干燥工藝影響大曲的揮發性物質主要指向長鏈酯類，大曲經過貯存后，熱風干燥影響貯存期大曲的揮發性物質轉為指向醇類和烷烯類。

該研究結果為進一步探究熱風干燥工藝對制曲工業化提供了參考，熱風干燥對貯存期大曲的理化生化、微生物等指標是否有促進性影響有待進一步研究，以更完善全面地反映其影響。