不同中藥對脂多糖刺激RIMVECs后PMNs殺菌酶釋放及內源性 抗菌肽表達的影響

高洋　朱雯雨　穆祥

摘要：為比較黃連、白頭翁、秦皮、黃柏和馬齒莧對脂多糖（LPS）刺激大鼠腸黏膜微血管內皮細胞（RIMVECs）后中性粒細胞（PMNs）釋放殺菌酶及內源性抗菌肽（rCRAMP）表達的影響。建立大鼠RIMVECs-PMNs的Transwell體系，試驗分為LPS對照組、LPS+黃連組、LPS+黃柏組、LPS+白頭翁組、LPS+秦皮組和LPS+馬齒莧組，運用ELISA和Western Blotting（WB）較全面系統地研究了以上5種中藥對LPS刺激RIMVECs后PMNs殺菌酶釋放及rCRAMP表達的變化。當LPS刺激RIMVECs后，與LPS對照組相比，LPS+黃連和LPS+白頭翁組PMNs彈性蛋白酶（NE）分泌量顯著增加；LPS+黃連和LPS+白頭翁組PMNs組織蛋白酶（CG）分泌量明顯增加，LPS+黃連和LPS+白頭翁組PMNs溶菌酶（LYS）分泌量極顯著增加，LPS+黃連組rCRAMP相對表達量顯著升高。結果表明，黃連和白頭翁明顯促進LPS刺激RIMVECs后PMNs釋放殺菌酶和表達rCRAMP，對機體起保護作用。

關鍵詞：中藥；脂多糖（LPS）；殺菌酶；內源性抗菌肽（rCRAMP）

中圖分類號：S853.74 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2018）05-0005-03

近年來，隨著中藥國際化進程的加快，中藥對于某些疾病良好的治療效果得到國際上廣泛認可，并且在歐美國家出現“中藥熱”現象。有研究發現，龍芩草因含黃芩苷、甘草苷、天冬氨酸、谷氨酸等對H1N1流感病毒有一定的抵抗作用[1]；黃連、黃柏、白頭翁、秦皮及馬齒莧等中藥可提高機體細胞免疫功能并能促進多種細胞因子的分泌[2-6]，常用于治療或輔助治療感冒等疾病。中性粒細胞可分泌彈性蛋白酶（NE）和組織蛋白酶（CG）調控機體炎癥反應[7，8]，溶菌酶（LYS）和內源性抗菌肽（rCRAMP）是天然的具有抗菌活性的蛋白質，中性粒細胞（PMNs）分泌LYS和rCRAMP是其能夠殺滅細菌的原因之一[9，10]。由于黃連、黃柏、白頭翁、秦皮及馬齒莧5味中藥對PMNs作用的影響未見詳細報道，故為探究以上5味中藥對脂多糖（LPS）刺激RIMVECs后PMNs釋放殺菌酶和表達rCRAMP的影響，本研究以RIMVECs和PMNs為研究對象，在成功建立大鼠RIMVECs-PMNs的Transwell體系基礎上，運用ELISA和Western Blotting（WB）試驗方法，較系統地闡述以上5味中藥對PMNs在炎癥反應中的影響，為黃連、白頭翁、秦皮等中藥在獸醫臨床中應用以及作為飼料添加劑等提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠，北京維通利華實驗動物技術有限公司。rCRAMP抗體，OmnimAbs公司；NE、CG和LYS檢測試劑盒，上海酶聯生物技術有限公司；白頭翁、黃連、黃柏、秦皮和馬齒莧，北京同仁堂藥店。

1.2 儀器設備

CO2培養箱，SANYO公司；電泳儀，BIO-RAD公司等。

1.3 方法

1.3.1 黃連、白頭翁、黃柏、秦皮和馬齒莧的煎制處理 取以上5種中藥各50 g，分別放入藥罐中，加10倍體積去離子水浸泡30 min。快火熬藥，待水沸騰后，調慢火維持沸騰30 min，收集藥液，使用200目篩趁熱過濾。加入8倍體積去離子水煎煮1 h，收集藥液，趁熱過濾。加入4倍體積去離子水煮1 h，收集藥液，趁熱過濾。將3次收集的藥液合并過濾，利用旋轉蒸發儀，將5種中藥水煎液的濃度濃縮至1 g/mL，于80 ℃真空干燥箱中干燥處理，冷卻后密封，于-20 ℃冰箱備用。

1.3.2 分組及處理 參考本實驗室已建立的鼠RIMVECs-PMNs的Transwell體系[4]，利用Transwell通透性支持物進行試驗。當體系中RIMVECs匯合至80%～90%時，用D-hanks清洗2次，將細胞分為6組，即LPS對照組（LPS+DMEM）、LPS+黃連組（LPS+HL）、LPS+黃柏組（LPS+HB）、LPS+白頭翁組（LPS+BTW）、LPS+秦皮組（LPS+QP）、LPS+馬齒莧組（LPS+MCX）。分別加入1.5 mL 10 μg/mL的LPS預處理4 h，藥物組分別加入1.5 mL上述中藥（200 μg/mL黃連、200 μg/mL黃柏、100 μg/mL白頭翁、500 μg/mL秦皮和1 mg/mL馬齒莧，通過預試驗獲得藥物安全濃度），LPS對照組加無血清的DMEM培養液，藥物組分別加入2.6 mL DMEM培養液，置于37 ℃的5%CO2中培養24 h。各組中加入提取好的PMNs（5×106個/mL），同時加入2.6 mL 2%1640培養基，孵育3 h后收集樣品并標記。

1.3.3 對PMNs遷移RIMVECs后釋放NE、CG和LYS的檢測 將細胞上清液以3 000 r/m離心10 min去除顆粒物，依據試劑盒說明書操作步驟進行NE、CG和LYS檢測，繪制標準曲線，計算NE、CG和LYS分泌量。

1.3.4 對PMNs遷移RIMVECs后rCRAMP的表達 提取細胞蛋白質，依據WB步驟檢測rCRAMP表達量，以目的蛋白質與actin的灰度比值表示目的蛋白質相對表達量。

1.3.5 數據處理與分析 本試驗數據使用Graphpad Prism5進行統計分析。數據以平均數±標準差（x±s）表示，采用獨立樣本t檢驗，P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著，有統計學意義；P>0.05表示差異不顯著，無統計學意義。

2 結果與分析

2.1 不同中藥對跨內皮細胞PMNs分泌NE、CG的影響

當LPS刺激RIMVECs后，依據不同中藥對RIMVECs遷移PMNs及正常未跨越RIMVECs的PMNs的NE和CG的分泌量繪制標準曲線（圖1、圖2），R2均大于0.95，根據試劑盒使用要求，繪制的標準曲線均可用。與LPS+DMEM組相比，LPS+HL和LPS+BTW組PMNs的NE分泌量顯著增加（P<0.05）；與LPS+DMEM組相比，LPS+HL組PMNs的CG分泌量極顯著增加（P<0.01），LPS+BTW組CG釋放量顯著增高（P<0.05），其余中藥組沒有顯著變化（圖3、圖4）。

2.2 不同中藥對跨內皮細胞PMNs分泌溶菌酶的影響

當LPS刺激RIMVECs后，測定不同中藥對RIMVECs遷移PMNs及正常未跨越RIMVECs的LYS分泌量，并繪制標準曲線（圖5），依據試劑盒使用要求R2大于0.95，即繪制的標準曲線可用。與LPS+DMEM組相比，LPS+HL和LPS+BTW組PMNs的LYS分泌量極顯著增加（P<0.01）；LPS+HB和LPS+QP組PMNs的LYS分泌量增加，但差異不顯著（P>0.05）（圖6）。

2.3 不同中藥對PMNs跨內皮后rCRAMP表達的影響

當LPS刺激內皮細胞后，LPS+HL組rCRAMP的相對表達量顯著升高（P<0.05），LPS+BTW和LPS+QP組rCRAMP的相對表達量也增加，但差異不顯著（P>0.05）。結果顯示在rCRAMP表達上，中藥黃連的保護作用更明顯（圖7、圖8）。

3 討論

NE是由PMNs分泌的炎癥介質，正常劑量NE可緩解感染對機體的損傷，但高劑量NE可降解膠原蛋白、層黏連蛋白以及細胞外基質，并通過EGFR、p38MAPK、ERK等信號通路調節黏液蛋白的分泌[7]。CG是由PMNs和單核細胞分泌產生的絲氨酸亞型組織蛋白酶，其通過水解活化細胞因子調控炎癥。當LPS刺激RIMVECs后，與LPS+DMEM組相比，LPS+HL和LPS+BTW組PMNs的NE分泌量顯著增加（P<0.05）；與LPS+DMEM相比，LPS+HL和，LPS+BTW組PMNs的CG分泌量極顯著或顯著增加（P<0.01，P<0.05），以上結果揭示黃連和白頭翁通過修復RIMVECs后，使得PMNs被激活釋放NE和CG，其作用機制可能為：黃連和黃柏含有豐富的黃連素、多糖等物質，而白頭翁含白頭翁素等有效成分，當LPS+黃連或白頭翁等作用細胞后，黃連素和白頭翁素可能與RIMVECs表面的受體相互作用進而激活胞內相關信號通路，被激活后的RIMVECs釋放大量趨化因子，如IL-18、IL-1和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子等，這些物質會刺激并激活PMNs，激活后的PMNs將胞內顆粒釋放到胞外，后者含大量NE和CG，能夠誘導炎癥反應[7]。

LYS是一種天然抗菌蛋白，由PMNs等炎癥細胞產生。主要針對革蘭氏陽性菌有殺滅或抑制作用。rCRAMP是哺乳動物體內具有抗菌作用的小分子多肽類物質，不同物種間內源性抗菌肽具有功能上的高度保守，具有抑制細菌、真菌、病毒等作用，又能促進趨化因子釋放，還可中和LPS并減輕內毒素性休克。rCRAMP是大鼠中惟一的內源性抗菌肽[9]，通過檢測LYS分泌量和rCRAMP表達量可更好的評判PMNs跨內皮細胞后的抑菌或殺菌功能。當LPS刺激RIMVECs后，與LPS對照組相比，LPS+HL和LPS+BTW組PMNs的LYS分泌量極顯著增加（P<0.01），LPS+HL組rCRAMP的相對表達量顯著升高（P<0.05），結果顯示，在rCRAMP表達水平上，黃連的抑菌殺菌作用最明顯。PMNs膜表面的整合素蛋白與RIMVECs膜表面的ICAM受體蛋白結合后，PMNs形態發生變化而穿過RIMVECs，PMNs吞噬LPS而被激活，釋放出LYS和rCRAMP，而黃連和白頭翁等中藥的有效成分進一步促進PMNs釋放出LYS和rCRAMP，所以表現出LPS+HL或BTW組PMNs釋放LYS和表達rCRAMP顯著增加。

黃連、白頭翁、黃柏、秦皮和馬齒莧對LPS刺激RIMVECs后PMNs的NE、CG、LYS和rCRAMP表達均有不同程度的影響，其中黃連和白頭翁的促進表達作用效果顯著，說明以上兩種中藥可通過顯著增加PMNs的溶菌酶釋放和抗菌肽表達來提升保護效果，本研究為以上5種中藥在獸醫臨床中的應用和作為飼料添加劑提供了理論依據。

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