18F-6-L-多巴自動化合成及其初步PET/CT顯像

文富華，張占文，馬 慧，張大可，唐剛華

(中山大學附屬第一醫(yī)院 核醫(yī)學科，廣東 廣州 510080)

18F-FDOPA是18F標記的氨基酸類似物，由于其有較長的半衰期，是診斷帕金森病和神經內分泌腫瘤較為理想的PET顯像劑[1-4]。十年前我國已成功合成18F-FDOPA，并做過臨床前試驗，但其合成路線繁瑣且產率較低而一直沒有應用于臨床[5-7]。國際上18F-FDOPA早已開始臨床應用，其臨床應用價值得到認可[8-11]，現已有比較成熟的合成方法，且產率較高。18F-FDOPA合成方法分為親電取代反應和親核取代反應，目前應用較多產率較高的方法是親核反應。親核反應法又有同位素交換親核取代法[12]、銅介導親核取代法[13]、相轉移催化親核取代法[14]和手性前體親核取代法[15]，其中最有臨床應用前景的制備方法為相轉移催化親核取代法。Lionel[14]于2013年利用手性催化劑進行相轉移親核取代法成功合成18F-FDOPA，并試圖將該工藝應用于商業(yè)化模塊。該方法合成18F-FDOPA產率最高且穩(wěn)定。本工作采用引進比利時ALLINONE 多功能合成儀和相轉移親核取代法自動化合成18F-FDOPA，測定其各項質量控制指標，并對大鼠進行初步microPET/CT顯像。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器與裝置

回旋加速器：Cyclone 10/5，比利時IBA公司；多功能合成儀：內置半制備HPLC(Waters SunFire C18 OBD 10 mm×250 mm，5 μm)，ALLINONE，比利時Trasis公司；放射性活度計：RC-15R，美國Capintec公司；高效液相色譜儀：1200Series，XDB-C18分析柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，美國Agilent公司；microPET/CT成像系統(tǒng)：Inveon microPET/CT，Siemens公司。

1.2 主要材料與試劑

試劑盒內試劑包括：3,4-二甲氧基-6-硝基苯乙醛(6-硝基藜蘆醛)、 Kryptofix 222(K2.2.2)、KOH、二氯甲烷(CH2Cl2)、HI、檸檬酸、NaBH4、抗壞血酸、N-(二苯基甲叉)甘氨酸叔丁酯、溴化-O(9)-烯丙基-N-(9-蒽甲基)辛可尼丁銨(PTC)：均由Trasis生產；卡比多巴：Sigma-aldrich公司。

1.3 實驗動物

本研究通過中山大學第一附屬醫(yī)院動物實驗倫理委員會的批準(批號no.2016.057)。Wistar 大鼠：清潔級，體重280～350 g，雄性,濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，許可證號為SCXK(魯)2014-0007。昆明小鼠：SPF級，18～22 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號為SCXK(湘)2013-0004。

2 實驗方法

2.1 18F-FDOPA的合成

本文參照Libert等[14]報道的方法進行18F-FDOPA合成，合成路線示于圖1。Libert等以化合物1(圖1)為起始原料在K2.2.2和碳酸氫鉀作用下先進行18F氟化反應，然后在C18柱上進行NaBH4還原生產化合物3，再與HI發(fā)生取代反應，生產化合物4，最后利用手性催化劑進行不對稱合成及還原、純化。該合成路線與本文合成路線基本相同，只有起始化原料稍有差異(圖1)。

2.2 自動化合成

進入18F-FDOPA生產程序進行前期準備：清除上次生產留下的合成廢液及HPLC廢液、裝卡套、卡套自檢、半制備HPLC準備及將試劑按對應字母順序插入卡套(圖2)，然后進行QMA柱、C18柱及干燥柱的預處理。C18柱分別用G瓶的乙醇及I瓶的注射用水進行預處理。抽取E瓶的CH2Cl21.5 mL加入D瓶中。準備工作結束，等待18F-傳輸。

回旋加速器通過核反應18O(p, n)18F生產18F-，并傳輸18F-至中轉瓶，啟動自動化合成程序進行18F-FDOPA合成。

2.2.1氟化反應 將18F-傳輸到6號注射器中，再由6號注射器推注使18F-靶水經5號QMA柱進入廢液瓶，18F-被QMA捕獲；然后A瓶K2.2.2溶液淋洗QMA柱，洗脫18F-至H1反應管。加熱H1反應管至110 ℃持續(xù)100 s干燥18F-；冷卻反應管至95 ℃，B瓶加入前體化合物1，加熱至165 ℃ 330 s進行氟化反應生成化合物2。反應管冷卻至室溫，從I瓶抽取5 mL水加入H1，然后抽出H1混合液通過C18柱，并通氮氣排出廢液，再從I瓶抽取10 mL水洗C18柱，并通氮氣排廢液；重復上述清洗操作一次，將純化后的化合物2吸附在C18柱上。

圖1 18F-FDOPA的合成路線Fig.1 The radiosynthesis route of 18F-FDOPA

圖2 18F-FDOPA自動化合成流程圖Fig.2 The flow chart of 18F-FDOPA automated synthesis

2.2.2還原反應 抽取F瓶的NaBH4緩慢通過C18柱，持續(xù)90 s，柱反應生成化合物3。

2.2.3碘代反應 排出C18柱中的液體至廢液瓶，抽取3 mL H瓶中的57% HI緩慢通過C18柱，與化合物3發(fā)生鹵化反應生成化合物4。抽取10 mL水沖洗管道，并通氮氣干燥；抽取10 mL水沖洗C18柱，并通氮氣干燥。抽3 mL二氯甲烷沖洗管道并干燥，然后用3 mL二氯甲烷洗脫C18柱至H2反應管，并通氮氣排出C18柱上的液體，重復此操作一遍，將所有產品淋入H2反應管。

2.2.4烷基化反應 將C瓶KOH和D瓶烷基化試劑(瓶希夫堿7及手性催化劑8，化學結構見圖1)加入H2反應管，室溫進行烷基化反應160 s生成化合物5。

2.2.5水解 依次抽取2 mL二氯甲烷、5 mL HI加入H2反應管，100 ℃下通氮氣80 s濃縮液體， 160 ℃進行脫保護,反應持續(xù)16 min生成化合物6，化學合成結束。

2.2.6高效液相(HPLC)分離純化 抽取12 mL水沖洗Loop環(huán)，并重復兩次。抽取4 mL水加入H2反應管，混勻后將混合液抽出注入Loop環(huán)；再抽取2 mL水加入H2反應管沖洗管壁，然后抽出注入Loop環(huán)，最后再重復洗管壁并注入Loop環(huán)一次。啟動HPLC進行純化分離，產品峰保留時間為8.5～9.5 min。收集產品并通過無菌過濾器進入無菌產品瓶。

2.2.7注射液調配 收集結束后，依次通過無菌過濾器加入J瓶抗壞血酸和K瓶檸檬酸鈉，調注射液pH至4～5.5，自動化合成結束。

2.2.8HPLC及管道清洗 合成結束后，模塊進入自動化后處理。HPLC柱的沖洗依次用乙醇和水進行沖洗；模塊管道用注射用水清洗，結束后退出程序、關閉電腦。

2.3 18F-FDOPA質量控制

目測溶液的澄清度和顏色；并用pH試紙測定18F-FDOPA注射液的pH；用帶有放射性檢測裝備的HPLC對18F-FDOPA注射液進行化學純度和放化純度檢測。HPLC分析條件：梯度洗脫：0～8 min和8～20 min，0.1%三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)的乙腈溶液與0.1% TFA的水溶液體積比分別取2∶98和10∶90，流速為1 mL/min，紫外檢測波長280 nm。無菌性培養(yǎng)：營養(yǎng)肉湯法，由本院檢驗科檢測；細菌內毒素、K2.2.2含量檢測、甲醇含量、乙醇含量、和二氯甲烷含量檢測委托廣東省微生物分析檢測中心完成；二甲基甲酰胺含量委托北京新奧環(huán)標技術服務有限公司完成。

2.4 異常毒性檢查

取5只17～20 g昆明小鼠，每只尾靜脈注射18F-FDOPA 0.5 mL(222 MBq, 96 nmol)，觀察48 h，期間正常進食、飲水。

2.5 18F-FDOPA microPET/CT顯像

Wistar大鼠提前禁食4～6 h,腹腔注射卡比多巴(10 mg/kg)，30 min后，10%水合氯醛麻醉(3.5 mL/kg)，尾靜脈注射18F-FDOPA(108～151 MBq/kg)，100 min后行頭部microPET/CT掃描。經衰減校正后，迭代重建，獲得橫斷面、矢狀面、冠狀面斷層圖像。實驗中對大鼠的處置依據中山大學附屬第一醫(yī)院動物倫理委員會批準的程序進行。

3 實驗結果

3.1 18F-FDOPA自動化合成

18F-FDOPA的制備型HPLC圖譜示于圖3。回旋加速器以32 μA束流轟擊35 min，18F-從回旋加速器傳輸至中轉瓶，得到18F-2.8×104MBq。18F-經過中轉瓶傳輸至合成模塊，通過氟化、還原、碘化、烷基化和水解多步反應，反應液轉移至半制備HPLC進行分離純化，再通過無菌過濾器進入產品瓶，最后進行注射液調配，得到18F-FDOPA注射液，共用時80 min。校正放化合成產率(63.1±3.8)%(n=10)，比活度大于1.9 GBq/μmol。半制備型HPLC純化以磷酸-磷酸二氫鈉緩沖液(pH=4)為流動相，流速5 mL/min，18F-FDOPA保留時間為8.5～10.5 min(圖3 )。

圖3 18F-FDOPA的制備型HPLC圖譜 Fig.3 The retention time of the prepared HPLC

3.2 18F-FDOPA質量控制

按照《醫(yī)療機構制備正電子類放射性藥品管理規(guī)定》2006版對18F-FDOPA進行全面的質量控制，包括澄清度、pH、放射性核純度、放化純度、放射性濃度、穩(wěn)定性、K2.2.2含量、甲醇含量、乙醇含量、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、以及無菌檢查、細菌內毒素檢查、異常毒性檢查等檢測。質量檢測結果列于表1。將18F-FDOPA和標準品氟代多巴(19F-FDOPA)混合同時注入HPLC進行分析，HPLC分析圖譜示于圖4。由圖4結果可知，其出峰時間分別為7.78 min(放射性峰A)和7.38 min(紫外吸收峰B)。18F-FDOPA放射峰A與標準品19F-FDOPA峰B兩者僅相差0.4 min，證實合成的產品是18F-FDOPA。

表1 18F-FDOPA質量控制標準及檢測結果Table 1 18F-FDOPA quality control standards and test results

注：1) 半衰期法；2) 《中華人民共和國藥典》(2015年版)四部 通則 0861 殘留溶劑測定法；3) 《中華人民共和國藥典》(2015年版)四部 通則1143 細菌內毒素檢查法(動態(tài)濁度法)。

a——18F-FDOPA峰；b——標準品19F-FDPA峰，紫外吸收280 nm圖4 分析型HPLC分析圖譜a——The radioactive chromatogram of 18F-FDOPA;b——The UV chromatogram (280 nm) of 19F-FDOPAFig.4 HPLC analysis of purified 18F-FDOPA solution co-injected with the standard 19F-FDOPA

3.3 異常毒性檢查

全部小鼠在注射18F-FDOPA后 48 h內無異常無死亡情況發(fā)生。

a——橫斷面；b——冠狀面 (箭頭指示紋狀體)圖5 Wistar大鼠18F-DOPA PET/CT腦顯像a——Transverse plane；b——Coronal plane (arrows point to the striatum)Fig.5 18F-FDOPA PET/CT brain images of normal wistar rats

3.4 18F-FDOPA microPET/CT顯像

正常wistar大鼠microPET/CT顯像結果示于圖5，雙側紋狀體見對稱性放射性攝取。紋狀體與腦白質攝取比值為1.38，紋狀體顯像清晰，邊界分明。

4 討論

18F-FDOPA是L-dopa類似物，已被證實具有多巴胺能系統(tǒng)PET顯像作用。從八十年代開始，就一直不懈的研究其合成方法及臨床應用。因為18F-FDOPA是具有不對稱結構的芳香氨基酸，其合成路線冗長、復雜且收率低，一直沒有得到廣泛的推廣及應用。使用多功能合成儀,采用本文合成方法及工藝，18F-FDOPA校正放化合成產率達(63.1±3.8)%(n=10)，高于文獻報道(36.3±3)%產率[16]。該合成工藝能一次合成18F-DOPA注射液可供15～20人進行PET/CT掃描用藥，完全滿足臨床需求。使用一次性卡套及藥盒進行放射性藥物的合成，不僅避免了繁瑣的清洗與維護程序，縮短工作人員合成前期準備時間，而且降低了多品種、多批次生產時交叉污染的可能性，實現藥品生產質量管理規(guī)范(good manufacturing practices, GMP)條件下18F-FDOPA 的生產。本方法合成18F-FDOPA雖然產率高，但也存在一定問題。因反應步驟多、程序復雜、卡套生產工藝不夠成熟，有任何一步出現偏差都可能導致合成失敗。所以，必須嚴格按照操作規(guī)程進行操作，并及時排除故障。

18F-FDOPA注射液為無色透明弱酸性液體，放化純度、放射性核純度及比活度均符合相關檢驗標準，殘留溶劑均在規(guī)定范圍內且遠小于規(guī)定值，細菌內毒素、無菌檢測及異常毒性檢測均合格。結果表明，本文所述的多功能模塊及配套藥盒按自動化工藝生產純化并調配的18F-FDOPA注射液符合放射性藥品質量檢測要求，可應用于動物和臨床PET顯像。

5 結論

以3,4-二甲氧基-6-硝基苯乙醛(6-硝基藜蘆醛)為前體，使用ALLINONE多功能模塊進行18F-FDOPA的放射性合成，共耗時80 min，校正放化合成產率(63.1±3.8)%(n=10)，放化純度大于98%。該工藝是目前自動化合成18F-FDOPA產率最高的方法，但其合成時間長，操作步驟多，有待進一步優(yōu)化合成過程。18F-FDOPA各項質量控制指標符合放射性藥品一般質量要求。初步PET顯像結果表明，18F-FDOPA在雙側紋狀體中具有對稱性放射性攝取，為進一步行臨床帕金森病PET顯像提供了實驗依據。