16-表雌三醇的合成及放射性標記

劉炳楠，熊利平，姜申德，要少波

(1.天津醫科大學總醫院 PET/CT影像診斷科，天津 300052；2.天津醫科大學總醫院 血液內科，天津 300052；3.天津大學 藥物科學與技術學院，天津 300072；4.中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院 核醫學科，北京 100730)

1955年，Marrian成功從孕婦尿液中分離得到一種雌激素化合物，經結構表征后確定是16-表雌三醇[1]，表雌三醇是在Marrian和Doisy從孕婦尿液中分離得的雌三醇后的又一種雌激素[2-3]。在隨后的數十年中，又有許多種雌激素被發現并確定結構，例如16α-羥基雌酚酮[4]、16β-羥基雌酚酮和16-羰基-17β雌二醇[5-6]、18-羥基雌酚酮[7]等。16-表雌三醇具有甾體的化學結構，屬于糖皮質激素，其主要臨床應用是制備抗炎藥物[8-10]；并且，除了糖皮質激素作用以外，16-表雌三醇還是正電子斷層顯像(positron emission tomography, PET)研究中放射性探針18F-FES(18F-16α-fluoro-17β-estradiol)的合成前體[11]，18F-FES在PET臨床研究中主要用于特異性結合原發和繼發乳腺癌腫瘤細胞中表達的雌激素受體水平，能夠早期精準診斷乳腺癌[12-14]。因此在臨床中，表雌三醇的用處很多。

迄今為止，16-表雌三醇主要通過化學合成，已知的表雌三醇合成方法主要有：在Huffman報道的合成路線中，以雌酚酮為起始原料經過5步反應，包括16-肟基衍生物制備、酯化反應、還原水解肟基和乙烯醇的氫化還原[15]，這條合成路線較低的收率限制了表雌三醇的大規模生產；1957年，在Biggerstaff報道的合成路線中，主要包括四醋酸鉛氧化和氫化鋰鋁還原反應[16]，該路線用到了重金屬鉛化合物，對環境污染較大，還用到了易燃易爆的試劑氫化鋰鋁，該路線不適合大規模生產；1983年，Numazawa報道了另外一條合成路線，包括溴代反應、醇酮重排和PdCl2催化還原[17]，該路線中用到的單質溴容易揮發，對實驗條件要求較高，對環境尤其是空氣污染較大，并且還用到了價格昂貴的鈀試劑。

本研究報道了兩條以雌酚酮為起始原料合成16-表雌三醇的簡便合成路線，主要包括乙酰化、選擇性保護、脫保護、氧化還原和重排等反應，反應條件溫和、收率較高、所用試劑成本低，適合放大生產。同時，在對16-表雌三醇進行結構修飾后，完成了18F-FES的放射性標記和注射液的質量控制，經檢測，制備的18F-FES注射液滿足臨床要求。

1 儀器與試劑

1.1 主要儀器

電磁攪拌器：德國IKA；熔點測定儀：奧地利Reichert-Thermovar；1H NMR譜數值測定儀Viarian INOVA(400 MHz或500 MHz)：德國Bruker公司，使用四甲基(δ=0.00)作為內標，偶合常數用Hz作為單位，峰形分別記為s(singlet)、d(doublet)、t(triplet)、br(broad)和m(multiplet)；快速硅膠柱色譜：300～400目柱層析硅膠；薄層層析色譜檢測鋁板(Kieselgel 60 F254)：德國Merck公司，通過UV和高錳酸鉀氧化顯色；Cyclone RDS111加速器：德國Siemens公司；PET-MF-2V-IT-I型氟-18多功能合成模塊：北京派特科技有限公司；Waters HPLC工作系統：美國Waters公司。

1.2 主要試劑

18-冠-6(18-Crown-6)、無水乙腈(MeCN，99.9%)、叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMSCl)：美國Sigma-Aldrich公司；乙酸乙酯、石油醚(60-90)、乙醇、二氯甲烷、醋酐、吡啶、醋酸、四氫呋喃、硼氫化鉀、氫氧化鈉、高氯酸：天津江天化工；標準品19F-FES：德國ABX公司；Sep-Pak light QMA柱和Sep-Pak plus C18柱：美國Waters公司。QMA柱的預處理(活化)依次用NaHCO3(8.4%水溶液)和注射用水沖洗；C18柱的預處理(活化)依次用乙醇和注射用水沖洗。

2 實驗方法

2.1 16-表雌三醇的合成路線1

2.1.1烯醇二醋酸酯2的合成

對雌酚酮的雙乙酰化步驟參照文獻[18]，合成路線示于圖1，將雌酚酮(13.50 g，50 mmol)溶解于醋酸異丙烯酯(120 mL，1.1 mol)，并加入對甲苯磺酸(4.05 g，23.5 mmol)，攪拌下加熱回流3.5 h。將反應溶液冷卻，減壓旋干溶劑，向反應瓶中加入乙酸乙酯300 mL將殘余物溶解，依次用冷的5%碳酸氫鈉和水洗，并用無水硫酸鈉干燥，將有機溶劑旋干后即得到類白色固體，用乙酸乙酯重結晶得到白色固體12.5 g，收率73%，熔點147～149 ℃，文獻149～150 ℃[18]。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ,0.94(s,3H,18-CH3),2.20(s,3H,-OCOCH3),2.30(s,3H,-OCOCH3),5.54(d,1H,J=1.3 Hz,16α-H),6.82-7.28(m,3H,aromatic)。鑒定為目標產物。

2.1.2環氧化物3的合成

將化合物2 (6.40 g，18 mmol)、70%間氯過氧苯甲酸(8.90 g，36 mmol)溶解在170 mL二氯甲烷中，置于室溫攪拌2 h，反應完畢使用5%碳酸氫鈉和水洗，并用無水硫酸鈉干燥并將溶液蒸干后得到類白色固體，在乙酸乙酯中重結晶得到白色固體4.35 g，收率65%，熔點148～151 ℃，文獻150～152 ℃[18]。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ,0.95(s,3H,18-CH3),2.13(s,3H,-OCOCH3),2.30(s,3H,-OCOCH3),3.94(s,1H,16β-H),6.81-7.28(m,3H,aromatic)。鑒定為目標產物。

2.1.3雌三醇4的合成

向含有5.83 g環氧化物3的乙醇溶液116 mL，并緩慢加入硼氫化鉀(1.20 g，22.2 mmol)和氫氧化鉀(5.03 g，89 mmol)的24 mL水溶液，將混合溶液置于室溫攪拌反應1 h，減壓旋蒸除去大部分乙醇，并加入50 mL 5%稀鹽酸溶液，并用80 mL乙酸乙酯萃取3次，將乙酸乙酯溶液合并后用無水硫酸鈉干燥并旋干得到固體，并用乙酸乙酯重結晶得到白色固體即為雌三醇3.63 g，收率80%，熔點275～280 ℃，文獻279～284 ℃[19]。1H NMR(400 MHz,MeSO-d6)δ,0.67(s,3H,18-CH3),3.79-3.88(m,1H,16α-OH),4.59(d,1H,J=5.1 Hz,17α-H),4.66(d,1H,J=4.8 Hz,16β-H),6.43-7.04(m,3H,aromatic),7.96(s,1H,17β-H),8.97(s,1H,3-OH)。鑒定為目標產物。

圖1 16-表雌三醇的合成路線1Fig.1 The first synthetic route of 16-epiestriol

2.1.416α-叔丁基二甲基硅基雌三醇5的合成

選擇性保護16α-羥基的實驗步驟參考已發表文獻方法[19-20]，將雌三醇(2.00 g，6.9 mmol)和咪唑(1.10 g，16.6 mmol)溶于36 mL DMF中，冷卻至-40 ℃攪拌下逐滴加入溶有叔丁基二甲基氯硅烷(2.30 g，15.3 mmol)的10 mL DMF溶液，加畢在此溫度下攪拌反應1.5 h，隨后將反應溶液倒入冰水中靜置過夜，抽濾并收集沉淀，將沉淀復溶于50 mL乙酸乙酯中，乙酸乙酯溶液用水洗并用無水硫酸鈉干燥，減壓旋干溶劑后得到灰白色固體，用快速硅膠柱色譜分離得到白色固體2.2 g，收率79%，熔點192～195 ℃，文獻194 ℃[20]。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ,0.11(d,6H,J=2.1 Hz,-Si(CH3)2),0.81(s,3H,18-CH3),0.94(s,9H, -SiC(CH3)3),2.83(d,1H,J=3.8 Hz,17β-OH),3.59(d,1H,J=4.8 Hz,17α-H),4.09-4.13(m,1H,16β-H),4.59(s,1H,3-OH),6.58-7.17(m,3H,aromatic)。鑒定為目標產物。

2.1.53,17β-二乙酰-16α-叔丁基二甲基硅基雌三醇6

將化合物5(4.09 g，10.2 mmol)溶于16.1 mL吡啶和8 mL醋酐中，置于室溫攪拌過夜，將溶液倒入冰水中待沉淀充分析出過濾，將沉淀溶于100 mL乙酸乙酯中依次用水洗和無水硫酸鈉干燥，減壓旋干溶劑后使用快速硅膠柱分離得到白色固體4.7 g，收率95%，熔點108～110 ℃，文獻110～112 ℃[19]。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ,0.05(d,6H,J=5.6 Hz, -Si(CH3)2),0.80(s,3H,18-CH3),0.90(s,9H,-SiC(CH3)3),2.11(s,3H,-OCOCH3),2.30(s,3H,-OCOCH3),4.30-4.33(m,1H,16β-H),4.86(d,1H,J=5.6 Hz,17α-H),6.81-7.28(m,3H,aromatic)。鑒定為目標產物。

2.1.63,17β-二乙酰基-16α-雌三醇7

選擇性脫除硅保護基過程參照文獻報道[19,21]，將化合物6溶解于141 mL醋酸-四氫呋喃-水(3∶1∶1)溶液中，室溫攪拌24 h，加入200 mL乙酸乙酯并用碳酸氫鈉洗和無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干后得到類白色固體，通過快速硅膠柱色譜分離得到白色固體1.58 g，收率92%，熔點136～138 ℃，文獻132 ℃[20]和140 ℃[19]。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ,0.88(s,3H,18-CH3),2.17(s,3H,-OCOCH3),2.30(s,3H,-OCOCH3),3.73(s,1H,16α-OH),4.14-4.19(m,1H,16β-H),4.30(d,1H,J=4.1 Hz,17α-H),6.81-7.29(m,3H,aromatic)。鑒定為目標產物。

2.1.73,17β-二乙酰基-16-酮化合物8

氧化反應依照經典條件進行[22]，將化合物7(1.47 g，3.9 mmol)、1.8 g分子篩粉末、PDC(1.9 g，4.9 mmol)[23]加入18 mL二氯甲烷中，逐滴加入醋酸0.3 mL，將反應物置于室溫攪拌1.5 h，加入水稀釋并用60 mL乙酸乙酯萃取2次，合并有機相用無水硫酸鈉干燥后減壓蒸干溶劑得到棕色沉淀，使用快速硅膠柱色譜純化得到白色固體1.15 g，收率79%，熔點130～132 ℃，文獻133.5～135.5 ℃[24]。1H NMR(400 MHz CDCl3)δ,0.88(s,3H,18-CH3),2.21(s,3H,-OCOCH3),2.30(s,3H,-OCOCH3),5.13-5.15(m,1H,17α-H),6.84-7.31(m,3H,aromatic)。鑒定為目標產物。

2.1.816-表雌三醇9

還原反應過程類似于制備雌三醇4的過程，還原反應完畢后使用甲醇重結晶得到白色固體粉末，收率81%，熔點285～287 ℃，文獻281～289 ℃[16]。1H NMR(500 MHz,Me2SO-d6))δ,0.72(s,3H),4.05-4.28(m,1H,17α-H),4.55(br,1H,16α-H),6.42-7.02(m,3H,aromatic),9.00(s,1H,3-OH)。鑒定為目標產物。以雌酚酮為起始原料計，總收率19%。

2.2 16-表雌三醇的合成路線2

2.2.1化合物10的合成

合成步驟示于圖2，環氧化物的開環反應依照文獻中報道步驟[18]，將化合物3(1.00 g，2.7 mmol)、6.4 mL醋酸和混合酸(醋酸：高氯酸4∶1)混合后置于室溫攪拌反應2 h，加入100 mL乙酸乙酯并用冷的5%碳酸氫鈉和水洗，無水硫酸鈉干燥后旋干后得到棕紅色油狀物，加入醋酐和吡啶完成乙酰化反應，結束后萃取并旋干溶劑，用快速硅膠柱色譜分離，得到化合物10 0.89 g，收率89%，熔點164～167 ℃，文獻168～171 ℃[16]。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ,1.01(s,3H,18-CH3),2.14(s,3H,-OCOCH3),2.29(s,3H,-OCOCH3),5.46(d,1H,J=8.8 Hz,16β-H),6.82-7.29(m,3H,aromatic)。鑒定為目標產物。

2.2.2化合物8的合成

甾體D環的開環反應依照參考文獻中方法[18,25-26]，將化合物10(0.89 g，2.4 mmol)溶于26.8 mL甲醇和13.2 mL 5%氫氧化鉀水溶液中，室溫下攪拌反應5 h，將反應溶液倒入50 mL 2%稀鹽酸溶液中，并用80 mL乙酸乙酯萃取2次，合并有機相用無水硫酸鈉干燥并旋干，經醋酐和吡啶乙酰化后用快速柱色譜分離，得到白色固體0.54 g，收率61%。

2.2.3由化合物8制備表雌三醇

該合成步驟同2.1.8中描述，最終得到表雌三醇。以雌酚酮為起始原料計，總收率22%。

2.3 18F-FES前體合成與標記

2.3.1化合物11的合成

合成步驟示于圖3，將化合物9(50 mg，0.14 mmol)，1 mol/L氫氧化鉀水溶液(0.14 mL，0.14 mmol)，10 mL乙腈混合后攪拌反應10 min，得到白色的渾濁反應體系，旋蒸蒸干溶劑，再加入乙腈10 mL，蒸干，重復3次，向單口燒瓶中加10 mL乙腈，滴加甲氧基氯甲烷(20 mg，0.16 mmol)，常溫攪拌12 h，減壓旋干溶劑，加水20 mL，15 mL乙酸乙酯萃取3次，合并有機相并用無水硫酸鈉干燥，經快速柱色譜純化得到白色的固體中間體。將中間體和硫酰二咪唑溶解于干燥四氫呋喃中，并在冰浴條件下緩慢加入氫化鈉，室溫反應2 h后處理并經快速柱色譜分離純化，得到白色固體11。1H NMR(CDCl3):7.18(d,J=8.5 Hz,1H,H-1),6.85(dd,J=8.5 Hz,2.5 Hz,1H,H-2),6.79(d,J=2.5 Hz,1H,H-4),5.16(m,overlapping,1H,H-16),5.15(s,2H,OCH2),4.60(d,J=7.5 Hz,1H,H-17),3.48(s,3H,OCH3),2.95-2.84(m,2H),2.50-2.24(m,overlapping,3H),2.14-2.10(m,1H),1.92-1.80(m,2H),1.68-1.54(m,3H),1.02(s,3H,18-CH3)。鑒定為目標產物。

圖2 16-表雌三醇的合成路線2Fig.2 The second synthetic route of 16-epiestriol

2.3.218F-FES的放射性標記

回旋加速器通過18O(p,n)18F核反應生產得到18F離子，經過QMA柱俘獲后用18-Crown-6/KHCO3的乙腈-水混合溶液1 mL淋洗到反應瓶中；通氮氣(100 mL/min)并在116 ℃加熱條件下將液體蒸發至干燥；加入1.5 mL無水乙腈，通氮氣并加熱至116 ℃，使殘留的水和乙腈共沸再次除水；將5 mg前體11的乙腈溶液加入至含有活性[18F]KF/18-Crown-6/KHCO3的反應管，在封閉的反應管中加熱至100 ℃并保持20 min；鼓氮氣將反應管中的乙腈在80 ℃下蒸干，將0.1 mol/L稀鹽酸溶液加入至反應管，加熱至140 ℃保持15 min，再次加熱至80 ℃下鼓氮氣除去混合溶液中的乙醇；使用半制備液相色譜進行分離純化，流速為5 mL/min，流動相為50%(乙醇/水)，收集產物峰(保留時間為7 min左右)并加入適量生理鹽水稀釋使乙醇含量小于10%，將含有18F-FES的注射液的通過0.22 μm的無菌濾膜至無菌產品瓶中，18F-FES注射液使用radio-HPLC分析其放化純度，Waters系統分析型HPLC: Waters C18柱，4.6 mm×250 mm;流速:1 mL/min;流動相:乙醇∶水=1∶1。

3 結果與討論

3.1 化學合成

兩條表雌三醇的合成路線中，以雌酚酮為起始原料，經過簡單的反應，分別得到19%和22%表雌三醇，各步反應產物經過了熔點和1H NMR譜確定其結構身份。反應簡單、收率較高，較適合放大生產。

3.2 放射性標記

以化合物11為前體，經過兩步簡單的氟化和水解反應，產物并經過半制備HPLC分離純化即得。18F-FES注射液可在60 min內完成制備，注射液為無色澄清透明的溶液，pH為6.5～7.5，放化收率(30±4)%(n=7)，比活度(1.75±0.25) Ci/μmol。注射液經過分析型radio-HPLC檢測，保留時間為11.9 min，放化純度>99%(圖4)，滿足臨床要求，與標準品19F-FES經HPLC檢測的紫外譜圖對比保留時間一致，可確定合成產物為18F-FES。

圖4 18F-FES注射液的radio-HPLC分析Fig.4 Radio-HPLC analysis of 18F-FES injection

3.3 合成中無法進行的化學反應步驟

對甾體環的16α-羥基進行結構修飾和反應時，總結了幾種不成功的反應，具體示于圖5。

3.3.116α-羥基硅保護基的脫保護

在脫除化合物6的16α-羥基的叔丁基二甲基硅基保護基時，最初嘗試經典方法四丁基氟化銨-四氫呋喃系統[20-21,27-29]，發現并不奏效，即使時間延長至48 h，仍然沒有發生反應(通過TLC檢測)，與Laurent等[20]報道的實驗結果相悖，因此嘗試了Wu等[19]報道的方法，使用醋酸四氫呋喃-水的體系，該反應在溫和的條件下完成。

3.3.216α-羥基的Mitsunobu反應

當成功得到化合物7時，曾想是否可以通過Mitsunobu反應[30-31]直接將16α-羥基構型轉化變為16β-羥基，可直接得到表雌三醇。然而在嘗試反應過程中，親核試劑分別試過對甲苯磺酸和苯甲酸，攪拌10 h反應仍未發生。

圖5 實驗中無法進行的反應Fig.5 Representative failed reactions

3.3.316α-羥基的甲磺酰化

對化合物7的16α-羥基嘗試甲磺酰化反應，可以通過親核氟化反應，直接完成標記，進而得到16β-18F-FES，可以探究16β-18F-FES和18F-FES兩種雌激素結構類似物在體內的生物學活性差異，然而該磺酰化反應并未進行，反應過夜仍未發現產物。

總結以上三種針對16α-羥基進行的反應可以看出，由于18位甲基的空間位阻較大，導致針對16α-羥基進行的反應不容易發生，也就是不夠活潑，因此不能完成理想反應。

4 結論

本文中以雌酚酮為原料，成功完成兩種表雌三醇的合成路線，收率較高、產率穩定，條件溫和，適合放大生產。并以表雌三醇為前體進行結構修飾，成功制備滿足臨床要求的雌激素受體類PET顯像劑18F-FES，可為臨床使用提供有力支持。